超高效液相色譜法快速測定原料乳中的雙氰胺

丁娟芳，樊艷，呂玉珍，韋林洪

（1.揚州職業大學生物與化工工程學院，江蘇揚州225009；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇南京210023）

超高效液相色譜法快速測定原料乳中的雙氰胺

丁娟芳1，樊艷2，呂玉珍1，韋林洪1

（1.揚州職業大學生物與化工工程學院，江蘇揚州225009；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇南京210023）

建立了超高效液相色譜檢測原料乳中雙氰胺的分析方法。采用甲醇提取樣品中的雙氰胺，HILICS色譜柱為分析柱，流動相為乙腈-10mmol/L乙酸銨（90∶10，體積比），流速0.4mL/min，檢測波長230 nm。雙氰胺在0.006mg/L～10.0mg/L范圍內具有良好的線性關系，標準曲線方程為y=90.336x+0.994 6，R2=0.999 9。方法檢出限為0.05mg/kg，不同添加水平平均回收率在87.0%～91.6%之間，變異系數＜3.84%（n=6）。此方法操作簡便，可在15min內完成快速檢測，適用于原料乳中雙氰胺殘留的快速篩查。

超高效液相色譜；雙氰胺；原料乳

雙氰胺（Dicyandiamide），化學式C2H4N4，又名二氰二氨，是氰胺的二聚體。雙氰胺能夠抑制土壤中硝化細菌的活動，從而使氮肥在土壤中的轉化速度得到調節，減少土壤中氮的流失，減少溫室氣體排放[1-2]。2013年1月，新西蘭部分乳制品被爆檢測出少量雙氰胺，再次引起了人們對乳品安全的關注。現有資料顯示，雙氰胺本身屬于低毒物質[3]，目前也還沒有人或動物食用了雙氰胺后導致危害的報道，但由于缺乏官方的毒理數據，其風險評估結果仍未知[4]。作為硝化抑制劑或氮肥增效劑，雙氰胺廣泛用于中國、美國、日本、新西蘭等國家的化肥工業中。鑒于目前國內外乳制品質量安全事件頻發，乳產品供應鏈的源頭—原料奶的質量安全風險監控就必須更加全面和嚴格，原料奶的雙氰胺含量監測和篩查就顯得尤為必要。

目前，乳粉中雙氰胺的測定方法已有報道，多利用液相色譜-質譜法[5-8]進行檢測，硬件配置門檻較高，而原料乳中雙氰胺的檢測方法少見報道。本研究建立了一種高效、快速的測定原料乳中雙氰胺的高效液相色譜檢測方法，整個測定過程能在15min內完成，適用于檢測機構、乳品工廠等單位對原料乳中雙氰胺的初步篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1290超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（DAD）：美國Agilent公司；FA1604電子天平：上海天平儀器廠；Milii-Q超純水機：美國Millipore公司。

雙氰胺標準品（純度99%）：美國Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純）：美國TEDIA公司；乙醇、丙酮（色譜純）：上海凌峰化學試劑有限公司；實驗用水為超純水機制備。

1.2 色譜條件

AcclaimTMHILIC-10色譜柱（2.1×150mm，3μm）；柱溫：30℃；進樣量：1μL；流動相：乙腈：10mmol/L乙酸銨（90∶10，體積比），乙酸銨水溶液用10%冰醋酸溶液調至pH6.0；流速：0.4mL/min；檢測波長：230 nm。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取雙氰胺標準品0.025 g，置于50mL容量瓶中，用甲醇定容得到500mg/L的標準儲備液，用甲醇稀釋標準儲備液，配制成0.006、0.02、0.08、0.4、0.8、4.0、10.0mg/L的標準使用液。

1.3.2 樣品的制備

稱取1 g原料奶（精確至0.001 g），置于25mL具塞刻度試管中，加1mL 70℃熱水混勻，加入甲醇定容至滿刻度，劇烈振蕩3min后靜置5min，上清液經0.22μm有機系濾膜過濾，待HPLC分析。

2 結果與討論

2.1 樣品處理條件的優化

雙氰胺極性較強，可溶解于水、甲醇、乙醇等極性溶劑[9]，本實驗選擇了甲醇、乙醇、丙酮和乙腈4種溶劑對樣品中的雙氰胺進行提取，樣品加標量為1mg/kg，每組條件平行測定6次。加標回收率結果見表1。

表1 不同處理方法的回收率（n=6）Table1 The results of recovery of different approaches（n=6）

結果顯示，甲醇提取回收率最高，且與其他提取條件差異顯著（p＜0.05），故選擇甲醇作為萃取溶劑。

2.2 色譜條件的優化

雙氰胺是極性小分子化合物，在C18柱中幾乎無保留。HILIC色譜柱基于親水相互作用，能為強極性和親水性化合物提供合適的保留。本實驗通過標樣和處理液分離效果的嘗試，選擇了HILIC柱作為分析色譜柱。對雙氰胺的標準溶液在190 nm～400 nm范圍內進行掃描，發現在218 nm處有最大吸收波長，考慮到甲醇和乙腈的紫外吸收干擾，故選擇了相對紅移的波長230 nm作為檢測波長，并采用二極管陣列檢測器對其進行光譜掃描，以保留時間和三維光譜圖相似性系數進行定性。按上述波長條件，考察了不同配比的乙腈和乙酸銨水溶液作為流動相的分離效果，最終選擇了乙腈-10mmol/L乙酸銨（90∶10，體積比）作為流動相。色譜圖見圖1～圖3。

圖1 雙氰胺標樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of Dicyandiamide

圖2 空白樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank sample

圖3 加標樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank sample spiked with Dicyandiamide

2.3 方法線性范圍、檢出限、回收率和精密度

圖4 雙氰胺標準曲線Fig.4 Standard curve of dicyandiamide

參照上述實驗條件以標準使用液進行分析，標準物質濃度范圍在0.006mg/L～10.0mg/L內，質量濃度和峰面積有良好的線性關系（圖4）。方法檢出限以噪聲面積的三倍計算，為0.05mg/kg。在上述前處理和色譜條件下，在陰性樣品中添加標樣，進行不同水平的添加回收率和精密度實驗，每組條件測定6次。結果顯示，不同添加水平下，加標回收率均值在87.0%～91.6%之間，變異系數＜3.84%（表2）。結果表明本方法測定準確，加標回收率高，精密度好，能夠很好地滿足實際樣品的測定。

表2 雙氰胺加標回收率和精密度Table2 Recoveries and repeatability of dicyandiamide

3 結論

本文應用超高效液相色譜儀測定了原料乳中雙氰胺的含量，整個檢測可在15min內完成，具有快速、簡便、成本低等優點，方法精密度和回收率能滿足實際樣品檢測的要求，可實現對原料乳中雙氰胺殘留的快速篩查。

[1]MONAGHAN RM,SMITH LC,DE KLEIN C A M.The effectiveness of the nitrification inhibitor dicyandiamide(DCD)in reducing nitrate leaching and nitrous oxide emissions from a grazed winter forage crop in southern New Zealand[J].Agriculture,Ecosystems& Environment,2013(175)：29-38

[2]商照聰,高子勤.雙氰胺對碳酸氫銨在土壤中氮素轉化的影響[J].應用生態學報,1999,10(2)：183-185

[3]賈廣樂,王建峰,林祥梅,等.三聚氰胺等4種物質的毒性比較研究[J].中國畜牧獸醫,2008,35(12)：162-163

[4]羅季陽,楊倩,王欣,等.進口乳制品中雙氰胺對人類健康的風險概述[J].食品工業科技,2013,34(9)：277-279

[5]MACMAHON S,BEGLEY TH,DIACHENK O G W,et al.A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of economically motivated adulteration in protein-containing foods [J].Journal of Chromatography A,2012(1220)：101-107

[6]許嬌嬌,張京順,黃百芬,等.液相色譜-串聯質譜同位素稀釋法測定奶粉中雙氰胺的殘留[J].食品安全質量檢測學報,2013,4(2)：415-420

[7]黃芳,馬葉芬,吳惠勤,等.液相色譜-串聯質譜法快速測定奶粉中的雙氰胺[J].分析測試學報,2013,32(3)：271-274

[8]羅海英,冼燕萍,侯向昶,等.QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法測定乳粉中的雙氰胺[J].現代食品科技,2013,29(5)：1148-1152

[9]周靖平,金念祖.雙氰胺及其測定[J].中國衛生檢驗雜志,2007, 17(10)：1921-1922

Rapid Determination of Dicyandiamide in Raw Milk by Ultra High Performance Liquid Chromatography

DING Juan-fang1，FAN Yan2，Lü Yu-zhen1，WEI Lin-hong1
（1.College of Biological and Chemical Engineering，Yangzhou Polytechnic College，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.College of Food Science&Engineering of NJNU，Nanjing University of Finance Economics，Nanjing 210023，Jiangsu，China）

An ultra high performance liquid chromatography method was developed for determination of dicyandiamide in saw milk.Dicyandiamide was extracted by methanol，the sample was isolated on a HILICcolumn，using a mobile phase made up of acetonitrile and 10mmol/Lammonium acetate（90∶10，V/V）at a flow rate of 0.4mL/min，and detected at 230 nm.Dicyandiamide was well separated with a good linear relation ship in the range of 0.006 mg/L-10.0 mg/L，caffeine standard curve equation:y=90.336x+0.994 6，R2=0.999 9.The detection limit was 0.05mg/kg，recovery rate was in the range of 87.0%-91.6% at several spiked levels，and the coefficient of variance of method was less than 3.84%（n=6）.This method is simple，the whole determination process was completed with in 15min，making it applicable for analysis in dicyandiamide monitoring programmes in saw milk.

ultra high performance liquid chromatography；dicyandiamide；saw milk

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.024

2013-11-13

丁娟芳（1981—），女（漢），講師，碩士，主要從事食品生物技術研究。