果汁中柑橘屬成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

梁宇斌，牟靖芳，李曉明，梁德沛

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣東），廣東順德528300）

果汁中柑橘屬成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

梁宇斌，牟靖芳，李曉明，梁德沛*

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣東），廣東順德528300）

通過(guò)分析20條不同柑橘屬植物的trn L基因序列，設(shè)計(jì)柑桔屬植物特異性擴(kuò)增引物。通過(guò)對(duì)蘋(píng)果、梨、葡萄等多種水果成分的特異性篩選，建立檢測(cè)柑桔屬植物成分的SYB Green實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，該方法對(duì)柑桔DNA的檢測(cè)低限為0.1 pg/μL。用該方法檢測(cè)10種橙汁及其飲料商品，結(jié)果表明，該方法能夠檢測(cè)到橙汁中的柑桔屬植物成分。該方法可用于果汁或食品中柑桔屬植物成分的鑒別。

果汁；柑橘屬植物成分；trn L基因；實(shí)時(shí)熒光PCR；SYB Green

近年來(lái)，隨著人民生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的果汁及果汁飲料的消費(fèi)量也越來(lái)越大[1]。巨大的市場(chǎng)需求導(dǎo)致?lián)絺涡袨樯嫒牍袠I(yè)，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的利益。果汁鑒偽檢測(cè)技術(shù)的研究具有非常重要的實(shí)際意義。目前，人們鑒別摻偽果汁的方法多基于各種水果特有的標(biāo)志性化合物[2-5]。但是，果汁摻假手段越來(lái)越高明，從最初的簡(jiǎn)單勾兌水發(fā)展到現(xiàn)在的根據(jù)原果汁的特征圖譜進(jìn)行調(diào)配，導(dǎo)致開(kāi)展鑒偽工作的難度也越來(lái)越高[6]。

分子生物技術(shù)以其簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，可從基因水平分析食品原料及其產(chǎn)品的特性與來(lái)源，在食品生物成分的鑒別方面展現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景[7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研工作者開(kāi)始利用分子生物學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)果汁鑒偽檢測(cè)技術(shù)。Ng與Chang等[8]利用PCR技術(shù)檢測(cè)鮮榨橙汁與再生橙汁之間的區(qū)別。劉偉紅等[9]利用PCR技術(shù)根據(jù)橙UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白基因設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，研究出一種可用于果汁中的柑橘屬成分的檢測(cè)及鑒偽方法。韓建勛等[10]利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)出一種檢測(cè)果汁中梨成分的方法。Palmieri L.等[11]根據(jù)5S rRNA基因序列和ANS（anthocyanidin synthase）序列設(shè)計(jì)特異性引物，用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)食品中的桔子、菠蘿、藍(lán)莓、草莓成分。但未見(jiàn)利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開(kāi)展對(duì)果汁中柑橘屬植物成分進(jìn)行檢測(cè)及鑒偽的研究。

本研究通過(guò)分析多種柑橘屬植物trn L基因，設(shè)計(jì)柑橘屬植物特異性引物，擬建立一種可檢測(cè)果汁中柑橘屬植物成分的SYB Green實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，以其為果汁分子生物學(xué)鑒偽體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品材料

14種果實(shí)樣品，包括柑桔、臍橙、蜜桔、貢柑、葡萄柚、柚子、檸檬、梨、蘋(píng)果、山楂、香蕉、草莓、葡萄、獼猴桃，購(gòu)自超市；橙汁及橙汁飲料10種，其中100%橙汁4種（A、B、C、D），橙汁飲料6種（E、F、G、H、I、J），所有樣品均購(gòu)自超市。

1.1.2 PCR擴(kuò)增引物

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)選取20條不同柑橘屬植物的trn L基因序列（詳細(xì)見(jiàn)表1），通過(guò)Clustal X軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，找到同源性序列區(qū)間，再利用Beacon Designer7.9軟件設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性擴(kuò)增柑橘屬植物成分的引物：citrus-trnl-F：5′-GAAAGCGAAAAA GGGGGATA-3′，citrus-trnl-R：5′-GGGCAGTCAACTCCATTTGT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為69 bp，Tm值為79.7℃。以上引物序列由上海生工有限公司合成。

1.1.3 主要試劑

果汁DNA提取液：CTAB緩沖液[2%CTAB，100mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，1.4mmol/LNaCl，pH 8.0]；蛋白酶K溶液（20mg/mL）；1×TE緩沖液；其它試劑或溶劑均為分析純級(jí)或生化純級(jí)。

植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)采用的2×SYBR Premix Ex TaqTM購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

微量移液器：德國(guó)Eppendorf；三孔電熱恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；小型離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf；高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma；Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo；LightCycler 1.5熒光定量PCR擴(kuò)增儀：瑞士Roche。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

1.2.1.1 果汁DNA提取

取10mL果汁，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，4℃下12 000 r/min離心10min，去上清，留沉淀，重復(fù)上述步驟3次，將沉淀放于新離心管中，加入5mLCTAB緩沖液與40μL蛋白酶K溶液，振蕩混勻，將離心管放于60℃水浴中溫浴30min，期間不斷搖勻。隨后取1mL懸濁液到新離心管中，冷卻至室溫后，13000 r/min室溫離心10min；將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的氯仿，劇烈震蕩后，13 000 r/min離心15min，取水相至新的離心管中；加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置30min后，13000 r/min離心15min，去上清，留沉淀；加入600μL 70%乙醇進(jìn)行上下顛倒后，12 000 r/min離心5min，去上清，將離心管倒置，室溫放置10min～ 20min；加入100μL 1×TE緩沖液溶解沉淀；-20℃保存。

1.2.1.2 果實(shí)DNA提取

將不同的水果用解剖刀切碎后，取部分樣品于-20℃條件下進(jìn)行冷凍，隨后樣品放置于冷凍干燥儀中進(jìn)行干燥。將干燥后的樣品至于預(yù)冷的研缽中磨碎，隨后按照天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒的步驟對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。

1.2.2 DNA提取質(zhì)量的測(cè)定

取樣品DNA溶液2μL，用Nano Drop 2000型微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品DNA在波長(zhǎng)為260 nm和280 nm處的紫外吸收值，通過(guò)OD260/OD280比值和濃度值判斷DNA的純度和濃度。

同時(shí)，根據(jù)中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1204-2003《植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法》[12]，通過(guò)檢測(cè)DNA樣品中植物內(nèi)參照基因tRNA Leu基因，確定所提取DNA樣品的可擴(kuò)增性。其中空白對(duì)照以無(wú)菌超純水代替DNA樣品，陰性對(duì)照為牛肉DNA樣品，陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證DNA質(zhì)量的大豆DNA樣品。每個(gè)樣品各做2個(gè)平行管。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

DNA模板2μL（≤100 ng）；2×SYBR Premix Ex TaqTM試劑10μL；引物citrus-trnl-F和citrus-trnl-R各0.4μL（10μmol/L）；用無(wú)菌水補(bǔ)至總體積為20μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 sec；95℃變性10 sec，55℃退火30 sec，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)于Roche LightCycler1.5熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，閾值設(shè)置采用默認(rèn)值，同時(shí)保證閾值不小于陰性對(duì)照的最高熒光值，使陰性對(duì)照的Ct值大于40。隨后做溶解曲線分析，分析PCR產(chǎn)物的Tm值。每個(gè)樣品各做2個(gè)平行管。

1.2.4 引物通用性與特異性驗(yàn)證

以柑桔、臍橙、柚子、檸檬、葡萄柚、貢柑和蜜桔7種柑橘屬植物作為驗(yàn)證樣品，無(wú)菌超純水作為空白對(duì)照，驗(yàn)證citrus-trnl-F/R引物對(duì)擴(kuò)增柑橘屬植物的通用性；以梨、蘋(píng)果、山楂、香蕉、草莓、葡萄和獼猴桃7種常見(jiàn)用于生產(chǎn)果汁的果實(shí)作為參照樣品，柑桔作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌超純水作為空白對(duì)照，以確定該引物的特異性。

1.2.5 果汁中柑橘屬植物成分實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)

以濃度為100 ng/μL的柑桔DNA溶液作為驗(yàn)證樣品，進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?yàn)證特異性引物對(duì)citrustrnl-F/R的檢測(cè)靈敏度。在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中加入該模板2μL，使其終濃度分別為10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL、0.01 pg/μL。通過(guò)分析結(jié)果確定引物對(duì)柑桔DNA的最低檢出限。以無(wú)菌超純水作為空白對(duì)照。

表1 引物設(shè)計(jì)所參考的不同trn L基因片段信息Table1 Information of different trnL gene fragments used for the primer design

1.2.6 商品化柑橘類(lèi)果汁飲料的檢測(cè)

按照上述方法對(duì)10種橙汁及橙汁飲料進(jìn)行DNA提取并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，分析引物的可用性。以無(wú)菌超純水作為空白對(duì)照，以牛肉DNA為陰性對(duì)照；以柑桔DNA為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量

對(duì)柑桔、臍橙、柚子、檸檬、葡萄柚、貢柑、蜜桔、梨、蘋(píng)果、山楂、香蕉、草莓、葡萄和獼猴桃14種果實(shí)提取的DNA樣品進(jìn)行微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，其OD260/OD280均在1.7～2.0范圍之間。（詳細(xì)數(shù)據(jù)未顯示）。同時(shí)，根據(jù)SN/T 1204-2003利用植物通用引物（tRNA Leu基因）及探針對(duì)所有DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

擴(kuò)增結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照均正常，所有樣品均擴(kuò)增出典型的S型熒光信號(hào)曲線，結(jié)果表明所有樣品中均含有適合PCR擴(kuò)增的DNA。

2.2 引物通用性

為確定所設(shè)計(jì)的引物citrus-trnl F/R的通用性，用引物citrus-trnl F/R對(duì)柑桔、臍橙、柚子、檸檬、葡萄柚、貢柑和蜜桔7種柑橘屬植物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可見(jiàn)，引物citrus-trnl F/R均可對(duì)7種柑橘屬植物的基因組擴(kuò)增出熒光信號(hào)，擴(kuò)增曲線的Ct值分別為14.90±0.09、12.93±0.17、13.05±0.02、16.28±0.03、15.62±0.04、16.76±0.07和14.60±0.01；溶解曲線分析結(jié)果顯示各擴(kuò)增產(chǎn)物均在溫度（79.8±0.4）℃出現(xiàn)特征峰，且各種擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度與軟件預(yù)測(cè)的產(chǎn)物解鏈溫度無(wú)顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物citrus-trnl F/R對(duì)柑桔屬植物表現(xiàn)出較好的通用性。

圖1 植物內(nèi)參照基因tRNA Leu基因引物對(duì)及探針對(duì)樣品DNA的Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of 14 plants with plant universal primer and probe by Taqman real-time PCR method

圖2 引物對(duì)citrus-trnl F/R對(duì)7種柑桔屬果實(shí)的SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of 7 citrus plants with citrus-trnl F/R primers by SYBR Green real-time PCR method

2.3 引物特異性

為確定所設(shè)計(jì)的引物citrus-trnl F/R的特異性，用引物citrus-trnl F/R對(duì)梨、蘋(píng)果、山楂、香蕉、草莓、葡萄和獼猴桃7種非柑橘屬植物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可知，引物對(duì)citrus-trnl F/R對(duì)7種非柑橘屬植物的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果均為陰性，說(shuō)明引物對(duì)citrus-trnl F/R的特異性良好。

2.4 檢測(cè)靈敏度

從圖4可見(jiàn)，隨著DNA濃度的降低，擴(kuò)增曲線的Ct值不斷增大。DNA濃度為10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10 pg/μL和1 pg/μL 0.1 pg/μL時(shí)，樣品的擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，擴(kuò)增曲線的Ct值分別為15.77±0.01、19.90±0.03、24.10±0.05、28.57±0.12和31.75±0.73；DNA濃度為0.1 pg/μL時(shí)，兩個(gè)平行的結(jié)果均為Ct值＞36，擴(kuò)增曲線呈明顯上升趨勢(shì)，參考SN/T1204-2003的結(jié)果判斷方法認(rèn)為該擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性；DNA濃度為0.01 pg/μL時(shí)，樣品無(wú)形成典型擴(kuò)增曲線，其擴(kuò)增結(jié)果為陰性。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所設(shè)計(jì)的引物對(duì)citrus-trnl F/R的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度達(dá)到0.1 pg/μL柑橘屬植物DNA。

2.5 市售橙汁樣品檢測(cè)

對(duì)市售的橙汁及橙汁飲料按上述條件提取DNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖5。

擴(kuò)增結(jié)果顯示，空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常；4種100%橙汁（A、B、C、D）和6種橙汁飲料（E、F、G、H、I、J）樣品的擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性；溶解曲線分析顯示在（79.8±0.4）℃附近出現(xiàn)特征峰。擴(kuò)增結(jié)果表明，所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法能有效檢測(cè)到果汁中的柑桔屬成分。

圖3 引物對(duì)citrus-trnl F/R對(duì)7種非柑桔屬果實(shí)的SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of 7 non-citrus plants with citrus-trnl F/R primers by SYBR Green real-time PCR method

注：A.擴(kuò)增曲線；B.溶解曲線。

圖4 果汁中柑橘屬植物成分實(shí)時(shí)熒光PCR方法靈敏度的確定Fig.4 Sensitivity of real-time PCR method for citrus component in fruit juice

圖5 果汁中柑桔屬成分檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection result of citrus component in fruit juice samples

3 結(jié)論

編碼轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（Transfer RNA）的trn L基因位于植物葉綠體DNA的大單拷貝區(qū)。該基因內(nèi)有一個(gè)長(zhǎng)約390 bp～615 bp的內(nèi)含子。該序列的進(jìn)化情況經(jīng)深入研究積累了深厚的研究背景[13-14]。同時(shí)，該內(nèi)含子是植物葉綠體DNA中唯一的I型內(nèi)含子，其保守區(qū)與可變區(qū)交替所形成了保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)[15]。由于該序列擁有較高保守性，因此其常與相鄰的trn F基因一起用于系統(tǒng)發(fā)育分析以及植物品種鑒定的研究[16-19]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)柑桔屬植物trn L基因設(shè)計(jì)citrus-trnl F/R特異性引物，試驗(yàn)結(jié)果表明該引物具有良好的柑桔屬植物通用性，對(duì)柑桔、臍橙、柚子、檸檬、葡萄柚、貢柑和蜜桔7種柑橘屬植物均可擴(kuò)增出擴(kuò)增曲線；同時(shí)，該引物具有良好的物種特異性，對(duì)梨、蘋(píng)果、山楂、香蕉、草莓、葡萄、獼猴桃等7種水果均無(wú)交叉反應(yīng)。

所謂的實(shí)時(shí)熒光PCR就是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定性和定量的分析。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)以其高特異性、靈敏性、可定量、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的關(guān)注，越來(lái)越多地被用于食品成分的檢測(cè)中[20-22]。本實(shí)驗(yàn)所建立的SYB Green實(shí)時(shí)熒光PCR方法的靈敏度達(dá)到0.1 pg/μL柑橘屬植物DNA，與劉偉紅等[9]所建立的PCR方法的靈敏度10 pg/μL相比高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)，表明該方法的靈敏度較高。

本試驗(yàn)利用citrus-trnl F/R對(duì)10種市售橙汁和橙汁飲料樣品中的柑橘屬植物成分進(jìn)行檢測(cè)，所有樣品均能檢測(cè)出果汁中的柑桔屬成分。該方法具有特異性強(qiáng)、敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于果汁和果汁飲料中柑橘屬植物成分鑒別，為果汁鑒偽研究提供技術(shù)參考。

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Real-time Fluorescence PCR Method for the Detection of Citrus Component in Fruit Juice

LIANG Yu-bin，MU Jing-fang，LI Xiao-ming，LIANG De-pei*
（China National Quality Supervision and Testing Center for Food，Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision（Guangdong），Shunde 528300，Guangdong，China）

A real-time fluorescence polymerase chain reaction method using the fluorescence dye SYBR Green and aimed at citrus trn L gene sequence was established for detection of citrus DNA in fruit juice.The citrusspecific primers were designed according to the sequence alignment result between 20 different citrus trn L gene sequences.The citrus component could be detected by the citrus-specific primers with a limit of detection of 0.1 pg/μL DNA.The following detection of 10 fruit juice and beverage samples showed that this method was suitable to identify the citrus component in fruit juice beverage and other relative food and can provide a technique base for research of fruit juice adulteration detection.

fruit juice；citrus component；trnL gene；Real-time PCR；SYB Green

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.022

2013-12-05

梁宇斌（1984—），男（漢），碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通信作者