煙草中果膠分析的前處理方法研究

程志穎，孔浩輝，*，王佳珺，胡漫妮，郭璇華

（1.廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣東廣州510385；2.華南理工大學(xué)，廣東廣州510641）

煙草中果膠分析的前處理方法研究

程志穎1，孔浩輝1，*，王佳珺1，胡漫妮2，郭璇華2

（1.廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣東廣州510385；2.華南理工大學(xué)，廣東廣州510641）

研究采用酸醇法快速萃取煙草及煙草制品中的糖和色素。以除糖液中糖含量和吸光度為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考察萃取溶劑的酸度、乙醇濃度、萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)除糖、除色素效果及果膠流失率的影響，開(kāi)發(fā)出一種快速有效地除糖、除色素而果膠流失率低的果膠分析前處理方法。

酸醇；煙草；果膠；前處理

果膠是植物體中一類復(fù)雜的膠體性質(zhì)糖類，主要存在于相鄰細(xì)胞壁的中間層及細(xì)胞液中。果膠的分子量約為2萬(wàn)～40萬(wàn)，以α-1，4鍵合的半乳糖醛酸為基本結(jié)構(gòu)，其中半乳糖醛酸的羧基可以不同程度地被酯化。酯化程度高的果膠物質(zhì)是與纖維素等細(xì)胞壁組成結(jié)合在一起的多聚半乳糖醛酸，不溶于水，稱為原果膠；酯化程度不高的果膠物質(zhì)多存在于細(xì)胞汁液中，是水溶性的，稱為水溶性果膠。煙葉中的果膠對(duì)煙葉的吸濕性[1-2]、卷煙香氣[3]、煙草吸味[4]等有較大的影響，而來(lái)源和加工工藝不同的煙葉中果膠的含量有較大的差異。因此，測(cè)定煙草及煙草制品中的果膠含量對(duì)煙草和煙草制品的品質(zhì)監(jiān)控有重要意義。

果膠的測(cè)定方法有直接法和間接法。直接法是將果膠分離出來(lái)后，用重量法直接測(cè)定果膠的含量[5]，其操作麻煩，費(fèi)時(shí)久。目前使用較為廣泛的方法是間接法，即首先采用酸解或酶解的方法將果膠分解成半乳糖醛酸，再通過(guò)測(cè)定半乳糖醛酸的含量來(lái)表征果膠的含量。測(cè)定半乳糖醛酸含量的方法有光學(xué)分析法[6]、色譜法[7-8]等。煙草中果膠的測(cè)定方法有比色法[9-10]、酶解-流動(dòng)分析法[11]、酶解-離子色譜法[12]等。由于煙草中含有大量的水溶性糖和色素，它們對(duì)流動(dòng)分析法和比色法的測(cè)定直接造成干擾，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。對(duì)于酶解離子色譜法來(lái)說(shuō)，由于可溶性糖對(duì)果膠酶活性有抑制作用，會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏低，而且大量的糖和色素如果直接上柱分析對(duì)色譜柱易造成污染，影響柱的壽命。因此，無(wú)論采用哪種方法分析，都必須先進(jìn)行除糖、除色素的預(yù)處理。除糖、除色素的方法有的采用80%的乙醇先浸泡一夜后再回流1 h；也有直接采用80%的乙醇回流1次～2次，每次1 h，這些方法均耗時(shí)較長(zhǎng)，操作也較麻煩。本文研究用酸醇法除糖和除色素，開(kāi)發(fā)了一種快捷有效地除糖和除色素而果膠流失低的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

連續(xù)流動(dòng)分析儀：SKALAR SAN++SYSTEM；紫外分光光度計(jì)：PerkinElmer；離子色譜儀：戴安ICS3000；電子分析天平：SarforiusBP0210S；電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 主要材料與試劑

半乳糖醛酸（AR）：Sigma；果膠酶：和氏璧生物技術(shù)有限公司；乙醇（AR）：廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸（AR）：衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司；醋酸鈉：Dionex；氫氧化鈉（50W/W）、苯甲酸：Sigma。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取1 g（精確到0.000 1 g）樣品于250mL的圓底燒瓶中，加入一定濃度的酸-醇溶液100mL，在一定溫度的水浴鍋中回流一定時(shí)間，然后用玻璃纖維濾紙抽濾，濾渣棄去，濾液定容到150mL，此為溶液A。

移取100.0mL溶液A于原來(lái)的圓底燒瓶中，在100℃水浴下濃縮至15mL左右，冷卻后轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，用一級(jí)水定容，此為溶液B。

1.3.2 基本分析方法

1.3.2.1 酸醇除糖液中色素的測(cè)定

取溶液A直接在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值，以吸光值為指標(biāo)比較不同條件下除色素的效果。

1.3.2.2 酸醇除糖液中糖含量的測(cè)定

移取B溶液10.00mL，加入10%的醋酸溶液10.00mL，按照YC/T159-2002《煙草及煙草制品水溶性糖的測(cè)定連續(xù)流動(dòng)法》[13]方法測(cè)定除糖液中糖的含量。

1.3.2.3 酸醇處理液中果膠的分析

移取B溶液10.00mL于100mL的磨口三角瓶中，依次加入pH=4.0的乙酸-乙酸鈉的緩沖溶液20mL，果膠酶溶液5.0mL，在55℃水浴中震蕩1 h。酶解液移入100mL的容量瓶中，用0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的苯甲酸溶液定容，此溶液經(jīng)過(guò)0.45μm的針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后，按照YC/T346-2010《煙草及煙草制品果膠的測(cè)定離子色譜法》[14]方法進(jìn)行離子色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的影響

稱取1 g（精確到0.000 1 g）樣品14份于14個(gè)250mL的圓底燒瓶中，7份分別加入乙醇濃度為0%、20%、40%、60%、70%、80%、90%的乙醇-水溶液100mL；其余7份分別加入鹽酸濃度為0.01mol/L，乙醇濃度為0%、20%、40%、60%、70%、80%、90%的酸醇-水溶液100mL，然后置于90℃水浴鍋中回流20min，按照1.3方法測(cè)定除糖、除色素的效果以及果膠流失率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 乙醇濃度對(duì)除色素效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on pigment elimination

圖2 乙醇濃度對(duì)除糖效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on sugar elimination

圖3 乙醇濃度對(duì)果膠流失率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on outflow rate of pectin

從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在保證果膠流失率低的情況下，即乙醇濃度在60%～90%范圍內(nèi)，酸醇溶液的除糖、除色素的效果及果膠流失率均優(yōu)于乙醇溶液。且以乙醇濃度為80%的酸醇溶液為最佳。

2.1.2 酸度的影響

稱取1g（精確到0.0001g）樣品8份于8個(gè)250mL的圓底燒瓶中，分別加入乙醇濃度為80%，鹽酸濃度分別為0.000、0.001、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mol/L的酸醇溶液，置于90℃水浴鍋中回流20min，按照1.3方法測(cè)定除糖、除色素的效果以及果膠流失率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4～圖6。

圖4 鹽酸濃度對(duì)色素去除效果的影響Fig.4 Effect of HCl concentration on pigment elimination

圖5 鹽酸濃度對(duì)除糖效果的影響Fig.5 Effect of HCl concentration on sugar elimination

圖6 鹽酸濃度對(duì)果膠流失率的影響Fig.6 Effect of HCl concentration on outflow rate of pectin

由圖4～圖6可見(jiàn)，色素的去除效果隨著酸度增大而增加；糖的去除效果受酸度的影響較小；而果膠流失率在鹽酸的濃度為0～0.015mol/L的范圍內(nèi)隨著鹽酸濃度的增大而減小，然后又逐漸上升。這是由于酸可以破壞薄壁細(xì)胞組織，使細(xì)胞中的色素溶于萃取劑中，而細(xì)胞壁上的原果膠也轉(zhuǎn)化成水溶性的果膠，甚至分解成半乳糖醛酸。但由于萃取劑含有80%的乙醇，果膠不溶于醇而沉淀出來(lái)，據(jù)資料報(bào)道[15]，乙醇對(duì)果膠的絮凝作用在痕量電解質(zhì)存在的條件下會(huì)更加完全，在酸醇溶液中，鹽酸起了酸和電解質(zhì)的作用。且由實(shí)驗(yàn)得：0.015mol/L的鹽酸能充分使果膠沉淀。

2.1.3 提取溫度的影響

稱取1g（精確到0.0001g）樣品6份于6個(gè)250mL的圓底燒瓶中，加入鹽酸濃度為0.010mol/L、乙醇濃度為80%的酸醇溶液100mL，分別置于50、60、70、80、90、100℃水浴中回流20min，然后按照1.3方法測(cè)定除糖、除色素的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7～圖8。

圖7 溫度對(duì)色素去除效果的影響Fig.7 Effect of temperature on pigment elimination

圖8 溫度對(duì)除糖效果的影響Fig.8 Effect of temperature on sugar elimination

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，色素的去除效果隨著溫度的上升而增加；而除糖效果則在80℃～100℃才隨著溫度的上升而上升，這是由于在50℃～80℃范圍內(nèi)，溶液尚未沸騰，而糖在低溫下可溶解，但是色素是溫度越高溶解度越大。由于乙醇的沸點(diǎn)較低，80%的乙醇在90℃時(shí)已處于沸騰的狀態(tài)，對(duì)萃取體系起到攪拌的作用，溫度越高，沸騰程度越激烈，因而溶劑與樣品接觸的越均勻。因此溫度可以選擇為90℃～100℃。

2.1.4 提取時(shí)間的影響

稱取1g（精確到0.0001g）樣品8份于8個(gè)250mL的圓底燒瓶中，加入鹽酸濃度為0.010mol/L的80%的酸醇溶液，置于90℃水浴鍋中回流10、15、20、25、30、40、50、60min，然后按照1.3方法測(cè)定除糖、除色素的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回流時(shí)間10min～60min對(duì)除糖、除色素的效果差別不大，從節(jié)省時(shí)間上來(lái)說(shuō)，20min已經(jīng)足夠。

2.2 除糖和除色素效果的正交試驗(yàn)

以除糖液中糖含量、除糖液吸光度和濾渣酶解液的吸光度為指標(biāo)，對(duì)提取溫度、酸度、乙醇濃度、提取時(shí)間4個(gè)主要因素采用L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table1 The factors and levels of orthogonal experiment

準(zhǔn)確稱取1g（精確到0.0001g）樣品9份于250mL的燒瓶中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品回流后過(guò)濾，濾液按照1.3方法測(cè)定除糖含量和除糖液的吸光度。濾渣放回原燒瓶中，加入100mL 2mol/L的鹽酸水溶液，于90℃下回流1 h，用蒸餾水稀釋至250mL。過(guò)濾后測(cè)定該溶液的吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2～表4。

表2 樣品中糖含量的正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 The orthogonal results of sugar content

由極差分析可知，各因素的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋舅岫龋咎崛r(shí)間＞提取溫度，最佳提取條件為A1B2C3D2，即提取溫度為90℃，酸度為0.010mol/L，乙醇濃度為70%，提取時(shí)間為20min。

由以上極差分析可知，各因素主次順序?yàn)椋核岫龋疽掖紳舛龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。樣品的最佳提取條件為A1B1C3D1，提取溫度90℃，酸度0.015mol/L，使用70%乙醇提取25min。

表3 除糖液中吸光度的正交試驗(yàn)結(jié)果Table3 The orthogonal results of absorbance in the solution A

表4 濾渣酸解液吸光度的正交試驗(yàn)結(jié)果Table4 The orthogonal results of absorbance in the enzymolysis solution

由以上極差分析可知，各因素主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋舅岫龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。由于分析的是濾渣酸解液的吸光度值，故其吸光度值越小，表明除糖、除色素越完全，故由實(shí)驗(yàn)得到濾渣酸解液的吸光度最低的提取條件為A1B1C3D2，提取溫度90℃，酸度0.015mol/L，使用70%乙醇提取20min。

正交試驗(yàn)的結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果基本相符，除糖液中的正交試驗(yàn)結(jié)果與濾渣酶解液中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也基本一致。故綜合各方面的因素考慮，除糖、除色素的條件為：乙醇濃度為70%～80%，鹽酸濃度為0.010mol/L～0.015mol/L，提取溫度為90℃～100℃，提取時(shí)間為20min～25min。

2.3 不同前處理方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

2.3.1 除糖除色素效果的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g（精確到0.000 1 g）樣品6份于6個(gè)250mL的圓底燒瓶，1～3號(hào)樣品加入含0.01mol/L鹽酸的80%的乙醇-水溶液100mL，置于90℃水浴鍋中回流20min，4～6號(hào)樣品按YC/T346-2010[13]方法加入80%的乙醇-水溶液100mL，置于100℃水浴鍋中回流1 h。冷卻后過(guò)濾，濾液按照1.3方法測(cè)定糖含量，濾渣放回原燒瓶中，加入100mL 2mol/L的鹽酸溶液，于90℃水浴鍋中回流1 h，用蒸餾水稀釋至250mL，過(guò)濾后測(cè)濾液的吸光度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同前處理方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)Table5 The comparative experiments of different pretreatment methods

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，酸醇法的除糖效果與乙醇法基本相同，但除色素的效果明顯優(yōu)于乙醇法，而且時(shí)間可以節(jié)省三分之二。

2.3.2 果膠流失率的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g（精確到0.000 1 g）樣品6份，1～4號(hào)置于4個(gè)250mL的圓底燒瓶，分別加入鹽酸濃度為0.000、0.005、0.010、0.015mol/L的80%的用乙醇溶液100mL，置于90℃水浴鍋中回流20min，過(guò)濾后將濾液移至原來(lái)的圓底燒瓶中，100℃下蒸去乙醇后過(guò)濾，濾液用一級(jí)水定容至150mL。5～6號(hào)樣品按YC/T159-2002[14]方法，置于250mL的磨口三角瓶中，加入5%（體積分?jǐn)?shù)）的醋酸溶液100mL，振蕩30min后過(guò)濾，濾液用5%的醋酸定容至150mL。

各取上述溶液2.00mL置于150mL的磨口三角瓶中，依次加入20mL pH=4.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，5mL果膠酶溶液，在55℃下恒溫振蕩1 h，然后轉(zhuǎn)移到50mL的容量瓶中，用0.1%的苯甲酸定容。然后用經(jīng)過(guò)0.45μm的過(guò)濾膜過(guò)濾后上離子色譜進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同前處理方法的果膠流失率Table6 The outflow rate of pectin with different pretreatment methods

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，在鹽酸濃度為0.005mol/L～0.015mol/L的范圍內(nèi)，酸醇溶液作為萃取劑時(shí)果膠流失率明顯低于80%的乙醇溶液，而采用5%的醋酸溶液作為萃取劑時(shí)，果膠流失嚴(yán)重。

3 結(jié)論

采用鹽酸濃度為0.01mol/L、乙醇濃度為80%的酸醇溶液作為萃取劑，可以快捷、有效地去除煙草中的水溶性糖和色素，而且果膠的流失率最低。

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The Research on Pretreatment Methods of Pectin in The Tobacco

CHENG Zhi-ying1，KONG Hao-hui1，*，WANG Jia-jun1，HU Man-ni2，GUO Xuan-hua2
（1.China Tobacco Guangdong Industrial Co.，Ltd，Guangzhou 510385，Guangdong，China；2.South China University of Technology，Guangzhou 510641，Guangdong，China）

In this paper，we extracted the sugar and pigment quickly in tobacco and tobacco products by acidethanol solvent.Utilizing the sugar content and absorbance as index，we investigated the effects of acidity，ethanol concentration，extraction temperature and time on the elimination of sugar，pigment and the out flow rate of pectin by the single factor tests and orthogonal experiments.We developed a pretreatment method of getting rid of the sugar and pigment fast with low out flow rate of pectin.

Acid-methanol solvent；tobacco；pectin；pretreatment

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.16.004

2013-07-02

廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目“連續(xù)流動(dòng)法測(cè)定煙草及煙草制品中的果膠含量”（粵煙工[2011]科字第014號(hào)）

程志穎（1974—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：煙草化學(xué)。

*通信作者：孔浩輝（1974—），高工，碩士，研究方向：煙草、煙用材料和香精香料分析與研究。