副豬嗜血桿菌四環素耐藥基因TetB的PCR檢測方法建立

江 軍，李軍星，康 磊，3，袁秀芳，徐麗華，王一成

副豬嗜血桿菌四環素耐藥基因TetB的PCR檢測方法建立

江 軍1，2，李軍星1，康 磊1，3，袁秀芳1，徐麗華1，王一成1

（1.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021；2.南京農業大學 動物醫學院，江蘇 南京 210095；3.安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230061）

在本實驗室前期研究的基礎上，選取與四環素耐藥表型相關性較好的TetB基因，建立PCR方法，以探索副豬嗜血桿菌耐藥性的快速檢測方法。本研究利用四環素主要耐藥基因TetB的引物，對PCR反應條件進行優化，以副豬嗜血桿菌基因組DNA為模板，未出現非特異性擴增條帶，PCR擴增條帶單一。將TetB基因克隆至pMD 19T載體，以重組質粒為標準品，確定了最低檢測拷貝數，經測定，最低檢測拷貝數為1.54×103。以不同稀釋度的21A7菌株基因組DNA為模板，確定了最低細菌檢出量，經測定，最低檢測細菌數量為4.6×103個。該方法為建立臨床快速檢測副豬嗜血桿菌耐藥性奠定了基礎。

副豬嗜血桿菌；耐藥基因TetB；PCR檢測

副豬嗜血桿菌（Haemophi1us parasuis，Hps）是豬格拉澤氏病（G1asser′s disease）的病原菌，引起豬多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎等［1］。近年來，豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環病毒病等免疫抑制性疾病常繼發Hps感染而增加發病率和死亡率，給養豬業造成了嚴重的損失［2］，是目前影響浙江省養豬業最嚴重的細菌之一［3］。

細菌對四環素產生耐藥的機制有3種。一是核糖體保護機制，編碼核糖體保護蛋白與核糖體結合，阻止四環素與核糖體的結合，保證細菌蛋白質順利合成，耐藥基因有TetM，TetO，TetS，TetW，TetQ，TetT等［4］；二是藥物排出泵機制，此機制是將進入細胞內的四環素由導出泵排出細胞外，四環素類藥物排出泵機制相關的耐藥基因包括TetA，TetB，TetC，TetD，TetE，TetG，TetH，TetI，TetJ，TetZ，Tet30，Tet31，TetK，TetL，OtrB，Tcr3，TetPA，TetV和TetY等［5］；三是酶鈍化機制，TetX基因是唯一通過產生滅活四環素的酶而使細菌耐藥的［6］。一般認為，革蘭氏陰性基因細菌的耐藥機制以抗生素的導出泵機制為主，對豬體內細菌及腸道細菌而言，其決定導出泵的耐藥性基因以TetB為主［7］。

本研究在前期浙江省副豬嗜血桿菌耐藥性調查中，確定了TetB為引起副豬嗜血桿菌四環素耐藥表型的最主要基因的基礎上，以TetB為檢測對象，通過條件優化，初步建立了副豬嗜血桿菌四環素耐藥表型的快速檢測方法，為臨床上防治副豬嗜血桿菌病合理使用抗菌藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

副豬嗜血桿菌菌株由本實驗室從浙江省臨床發病豬中分離保存，其中21A7菌株經本實驗室檢測，具備四環素耐藥性及TetB耐藥基因。PCR試劑及pMD 19T載體為TakaRa寶生物工程 （大連）有限公司產品，蛋白酶K購自生工生物工程 （上海）股份有限公司，細菌培養基購自OXOID LTD，其余試劑均為國產分析純。

1.2 菌株基因組DNA的提取

以蛋白酶K消化法［8］提取DNA。取400μL純培養的副豬嗜血桿菌菌液于1.5 m L離心管中，12 000 r·min-1離心3 m in；棄上清，加入400μL TE（pH值8.0）重懸菌體，12 000 r·min-1離心3 min；棄上清，加入400μL Tris（0.000 5%Tween-20，0.1mo1·L-1Tris，pH值8.5）重懸菌體，再加入6μL蛋白酶K（20 mg·m L-1），56℃作用45 m in，100℃再作用20 min，12 000 r·m in-1離心1 min。取上清作為模板進行PCR擴增。

1.3 PCR反應

［3］中的TetB引物，TetB1引物序列為5′-TGGTTAGGGGCAAGTTTTGG-3′，640 bp；TetB2引物序列為5′-GAGCATTGGTAAGGCTC-3′，640 bp。

PCR體系為25μL，包括1×PCR Buffer（含1.5 mM MgC12）、200μmo1·L-1dNTP混合物、各10 pmo1·L-1的上游引物及下游引物、0.2 U的r Taq聚合酶和2μL的模板DNA。

PCR運行程序為94℃預變性5 min；94℃變性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸30 s，進行32個循環；最后再72℃延伸5 m in。取5μL的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.4 重組質粒pM D19T-TetB的構建

連接。取TetB的PCR產物與pMD 19T Vector連接。連接體系為10μL，包括TetB的PCR產物4.5μL，pMD 19T Vector 0.5μL，So1utionⅠ5μL。將混合物置于16℃金屬浴中連接3 h。

轉化。將10μL的連接產物加入到100μL的大腸桿菌TOP10感受態細胞中，混勻，冰上放置30 min，42℃熱激45 s，冰上再放置1 min后加入700μL無抗性的LB液體培養基，放于37℃，200 r·min-1的搖床中1 h。然后取100μL菌液均勻涂布于含氨芐 （50μg·m L-1）抗性的LB平板上，37℃溫箱中過夜培養。

挑菌鑒定。從長菌的平板上隨意挑取5個單菌落分別至2 m L含氨芐（50μg·m L-1）抗性的LB液體培養基中，放于37℃，200 r·min-1的搖床中搖2 h。分別取2μL菌液作模板，進行PCR擴增。取5μL的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。取1 m L呈陽性的菌液送去華大公司測序。

提取重組質粒。取150μL陽性菌液于15 m L含氨芐 （50μg·m L-1）抗性的LB液體培養基中，放于37℃，200 r·min-1的搖床中過夜。取菌液按質粒提取試劑盒說明提取重組質粒pMD 19T-TetB。將提取的重組質粒混勻后分裝到1.5 m L的離心管中，用核酸蛋白分析儀測定重組質粒的濃度及純度（D260/D280），用作TetB基因的標準模板，存放于-20℃冰箱。

1.5 特異性試驗

選取不含四環素耐藥性的10個臨床菌株，進行純培養，以蛋白酶K消化法提取純培養細菌的基因組DNA，以總基因組為模板，進行TetB基因擴增，同時設以水為模板的陰性對照，以及以pMD 19T-TetB為模板的陽性對照。

1.6 敏感性試驗

1.6.1 對TetB基因的標準模板檢測敏感度

將上述所提的標準模板重組質粒pMD19T-TetB作10倍逐級稀釋，稀釋度為102～109。每個稀釋度分別取1μL作模板，進行PCR擴增。取5μL的PCR產物進行瓊脂糖電泳。

1.6.2 對TetB基因的標準模板檢測敏感度

復蘇21A7菌株于無抗性的TSA平板上培養過夜，取單菌落于2 m L無抗性的LB液體培養基中純培養3～4 h使其處于對數生長期。取100μL對數生長期菌液于1.5 m L離心管，用無抗性的LB液體培養基對菌液作10倍逐級稀釋，稀釋度為106～109。取各個稀釋度的菌液100μL涂于無抗性的TSA平板上，37℃溫箱過夜培養。根椐菌落數計算對數生長期純培養菌液的細菌濃度。

取500μL對數生長期的純培養菌液于1.5 m L離心管，以蛋白酶K消化法提取純培養的21A7細菌的基因組DNA。將DNA作10倍逐級稀釋，稀釋度為100～106。每個稀釋度分別取2μL作模板，進行PCR擴增。取5μL的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果與分析

2.1 TetB基因PCR擴增

以副豬嗜血桿菌基因組DNA為模板，擴增到約640 bp的基因片段，與預期大小相符 （圖1）。

圖1 TetB基因PCR產物的電泳結果

2.2 重組質粒pM D 19T-TetB的PCR鑒定

以菌液為模板進行TetB基因擴增，PCR結果顯示，隨機挑取的5個菌落都為陽性克隆 （圖2），測序結果證實為TetB基因。

圖2 pMD 19T-TetB的PCR鑒定結果

2.3 特異性試驗結果

對10個不同臨床分離株進行PCR擴增，電泳結果顯示，TetB的引物具有良好的特異性，與受試臨床分離株的基因組無非特異性擴增 （見圖3）。

圖3 特異性試驗PCR結果

2.4 敏感度

經測定，pMD 19T-TetB重組質粒的濃度為0.056μg·μL-1，D260/D280=1.843，符合實驗要求。該PCR方法的最低可以檢測到107稀釋的1 μL質粒 （圖4）。TetB基因的拷貝數=（6.02× 1023拷貝數·mo1-1）×（質粒濃度g·m L-1）/（核苷酸分子量g·mo1-1）=（6.02×1023拷貝數·mo1-1）×（5.6×10-5g·m L-1）/（2 195 160 g·mo1-1），未經稀釋的質粒為1.54×1013拷貝數·mo1-1。因此，重組質粒經107稀釋后1μL所含的拷貝數為1.54×103，即該PCR能檢測到的最低質粒含量為1.54×103個。

21A7菌株純培養菌液稀釋后，涂TSA平板后的長菌情況為106稀釋度的平板上長菌最多，約為230個單菌落，所以可知1 m L菌液中細菌的數目為230×106×（1 m L/100μL）=2.3×109個· mL-1。21A7菌株DNA各個稀釋度的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖5，該PCR方法可以檢測到103稀釋的2μL基因組DNA，即可以檢測到4.6×103個的細菌總DNA。

圖4 以重組質粒為模板的敏感性試驗結果

圖5 以副豬嗜血桿菌總DNA為模板的敏感性試驗結果

3 小結和討論

四環素具有抗菌譜廣、價格低廉等特點，因此是獸醫臨床最常用的抗生素之一。隨著四環素的大量使用，結伴而來的就是細菌耐藥性的激增，檢測四環素耐藥基因是判斷細菌四環素耐藥性的重要的快速手段。細菌四環素的耐藥基因有數十種之多，華中農業大學劉維紅等［9］對33株豬源沙門氏菌進行了TetA，TetB，TetC，TetD，TetE，TetG，TetK等四環素耐藥基因檢測，發現其中29株攜帶TetB基因，與四環素耐藥表型的符合率為87.9%，但并未在其他4個耐藥菌株中檢測到上述7種耐藥基因。這與本實驗室前期實驗發現的副豬嗜血桿菌TetB基因與四環素耐藥表型的符合率（80.56%）［3］較為接近。2010年張純萍等［10］從269株豬雞大腸桿菌中檢出TetA，TetB和TetM的比率為87.9%，28.4%和15.5%。因此，不同宿主來源或不同菌株中四環素耐藥基因的種類差異較大。

建立細菌耐藥性的快速診斷技術，對細菌性傳染病的治療具有重要的意義。目前臨床上細菌耐藥性檢測大多采用藥敏片試驗方法，需要較長檢測時間，難以快速診斷。本研究在綜合分析本實驗室前期有關副豬嗜血桿菌耐藥表型和耐藥基因相關性的基礎上，選取相關性較高的四環素耐藥基因為檢測對象，探索建立副豬嗜血桿菌四環素抗性的PCR快速診斷方法。所建立的PCR檢測方法與副豬嗜血桿菌基因組無非特異性擴增，最低可以檢測4.6 ×103個的細菌總DNA，可用于快速判斷實驗室培養的副豬嗜血桿菌耐藥性，克服了細菌培養檢測藥物敏感性需要較長時間的弊端，對于促進臨床合理應用抗生素將具有重要意義。但該方法不建議用于臨床病料樣品的直接檢測，因為病料中可能污染攜帶TetB基因的其他種類細菌而導致假陽性。

如前所述，細菌四環素耐藥基因種類多，包括TetA，TetB，TetC，TetD，TetE，TetG，TetH，TetI等，其中多個基因與副豬嗜血桿菌四環素耐藥表型的對應關系尚不明確，如進一步闡明副豬嗜血桿菌四環素耐藥性與各種耐藥基因的相關性，建立基于多種耐藥基因的多重PCR檢測方法，將進一步提升副豬嗜血桿菌四環素耐藥表型的快速檢測實用水平。

參考文獻：

［1］ O1iveira S，Pijoan C.Haemophi1us parasuis：new trends on diagnosis，epidem io1ogy and contro1［J］.Vet M icrobio1，2004，99（1）：1-12.

［2］ Narita M，Kawashima K，Matsuura S，et a1.Pneumonia in pigs infected with pseudorabies virus and Haemophilus parasuis serovar 4［J］.JComp Patho1，1994，110：329-339.

［3］ 忽占利，李軍星，胡松華，等.副豬嗜血桿菌分離株的耐藥性及耐藥基因分析 ［J］.華北農學報，2013，28（4）：228-233.

［4］ 許曉燕，王楷宬，鄒君等.2型豬鏈球菌對四環素的耐藥機制 ［J］.中國獸醫學報，2013，31（10）：1471-1475.

［5］ Chopra I，Roberts M.Tetracyc1ine antibiotics：mode of action，app1ications，mo1ecu1ar bio1ogy，andepidemio1ogy of bacteria1 resistance［J］.Microbio1 Mo1 Bio1 Rev，2001，65（2）：232.

［6］ 馮新，韓文瑜，雷連成.細菌對四環素類抗生素的耐藥機制研究進展 ［J］.中國獸藥雜志，2004，38（2）：38 -42.

［7］ Lee C，Lang1ois B E，Dawson K A.Detection of tetracyc1ine resistance determineants in pig iso1ates from tree herds with different histories of antimicrobia1 agent exposure［J］.App1 Environ Microbio1，1993，59（5）：1467.

［8］ de 1a Puente Redondo V A，NavasMéndez J，Garca de1B1anco N，et a1.Typing of Haemophilus parasuis strains by PCR-RFLP ana1ysis of the tbpA gene［J］.Veterinary M icrobio1ogy，2003，92（3）：253-262.

［9］ 劉維紅，徐引弟，郭愛珍，等.致病性豬沙門菌四環素耐藥基因tetB的PCR檢測 ［J］.中國抗生素雜志，2006，31（11）：51-55.

［10］ 張純萍，寧宜寶，宋立.健康雞豬體內大腸桿菌對四環素的耐藥性及耐藥基因分布 ［J］.中國農業科學，2010，43（12）：2578-2583.

（責任編輯：盧福莊）

S 854

B

0528-9017（2014）12-0000-00

文獻著錄格式：江軍，李軍星，康磊，等.副豬嗜血桿菌四環素耐藥基因TetB的PCR檢測方法建立 ［J］.浙江農業科學，2014（12）：00 -00.

2014-09-17

畜禽健康養殖科技創新團隊項目 （2010R50027）

江 軍 （1989-），女，河北保定人，碩士，Te1：15058127581，Emai1：1146050993@qq.com

王一成 （1957-），男，浙江溫嶺人，研究員，碩士生導師，主要從事豬病防控研究。E-mai1：95711@sina.com