激光掃描共聚焦光譜成像中的出射狹縫控制

苗舒越，張運海，高 飛

(1．中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所，江蘇省醫用光學重點實驗室，江蘇蘇州215163;2．中國科學院長春光學精密機械與物理研究所，吉林長春130033;3．中國科學院大學，北京100049)

1 引言

激光掃描共聚焦顯微鏡［1］(Laser Scanning Confocal Microscopy)是研究微細結構的有效技術手段和必備的大型科學儀器，在生物和工業檢測［2－3］領域得到了廣泛應用。光譜成像技術能夠實現空間圖像和光譜數據的統一［4］，共聚焦顯微鏡中光譜成像技術的引入［5］，使得共聚焦顯微鏡在保持高清晰度和層析成像能力的基礎上，能夠對組織樣本中的不同熒光成分進行選擇性成像，為開展各種復雜的生物學實驗［6－9］奠定了基礎。

光譜選擇是激光掃描共聚焦光譜成像系統的基礎。現有光譜選擇的實現方式有多通道探測器與移動狹縫兩種。多通道探測器方式使用很多個單元光電倍增管(Photomultiplier Tube)組成陣列式光譜儀，按光譜進行分段觀測，以實現特定譜段的選擇，蔡司(Zeiss)與尼康(Nikon)的共聚焦顯微鏡均采用此方式，由于PMT價格較昂貴，因此這種方式的設計制造成本較高;出射狹縫方式則是在光譜帶位置處設置一個可移動狹縫，通過改變狹縫的寬度和狹縫相對于光譜帶的位置，從而實現特定譜段的選擇，該方式熒光選擇靈活性好，實現方便，設計制造成本較低。

2 原理及方案

樣本發出的激發熒光經棱鏡分光后成像于譜面上，譜面處設置有兩個可以獨立移動的縫片，通過控制兩個縫片的相對移動，改變狹縫的寬度和狹縫的位置，從而只允許特定波段的熒光通過，如圖1(a)所示。系統中設計了三路這樣的光譜選擇通道，狹縫1的兩縫片表面鍍有反射膜，將到達縫片表面的光反射至通道 2、3，狹縫 1、2、3 分別選擇 PMT1、PMT2、PMT3上接收的光譜范圍，如圖1(b)所示。各通道觀測整個波段中的一部分，以實現同時對不同波段的熒光進行成像。

圖1 基于可移動狹縫的光譜選擇原理圖

項目組設計的光譜成像系統要求工作波長范圍為400～700 nm，最小光譜帶寬應優于5 nm，光譜帶寬范圍5～300 nm可調。通過計算得出，每個狹縫寬度的可調范圍為 0．04～6 mm，調節增量為 0．01 mm。

為保證位置精度，縫片由單步移動2．5μm的步進電機驅動，主控單元選用ARM芯片，其同時對三路通道的步進電機進行控制。每個狹縫的控制模塊均構成一個獨立的伺服控制系統，其中旋轉編碼器和光耦開關用來實現位置反饋。編碼器通過角度檢測反饋絕對位置，步進電機根據負反饋進行數次調整，以達到精確定位;光耦開關則在系統啟動時精確定位縫片的初始原點位置并實時檢測當前處于工作位置的狹縫，控制系統框圖如圖2所示。

圖2 出射狹縫控制系統框圖

3 設計與實現

3．1 步進電機控制

步進電機的控制信號需要兩路，如圖3所示。一個CW脈沖使步進電機正轉一個步距角，一個CCW脈沖使步進電機反轉一個步距角，其中CW脈沖與CCW脈沖同一時刻只能有一個存在，在步進電機正轉脈沖后需要等待一定的時間才能發送反轉脈沖，脈沖的頻率決定了步進電機轉動的速度。

圖3 步進電機控制時序

控制脈沖信號由作為主控單元的ARM生成，利用ARM控制器的GPIO輸出口，輸出兩路脈沖信號。在軟件上保證兩路脈沖信號不能同時存在，脈沖個數以及脈沖頻率可設定，控制電路如圖4所示。

圖4 ARM和電機驅動器連接原理圖

3．2 編碼器設計

編碼器的輸出信號為SSI同步串行信號，輸出格雷碼，SSI實際為兩對RS422，一對時鐘觸發，一對數據發送。SSI的時序如圖5所示，時鐘信號從ARM控制器發出，以編碼器的總位數輸出N個中斷的脈沖，編碼器的絕對位置值由時鐘信號觸發，從格雷碼的高位(MSB)開始，輸出與時鐘信號同步的串行信號。不傳送信號時，時鐘和數據位均是高位，在時鐘信號的第一個下降沿，當前位置值被儲存，從時鐘信號上升沿開始，數據信號開始傳送，一個時鐘脈沖同步一個數據。

圖5 SSI時序圖

利用ARM的GPIO模擬SSI時序，通過RS422芯片，實現差分時鐘信號的產生以及差分數據信號的接收。原理電路如圖6所示，RS422芯片選擇MAX3488，供電電壓3．3 V。MAX3488的單端信號輸入口DI連接ARM的GPIO輸出口，以接收時鐘信號;單端信號輸出口RO連接ARM的GPIO輸入口，將編碼器絕對位置信號傳送給ARM控制器。

圖6 編碼器與ARM連接原理圖

3．3 光耦開關設計

光耦開關選用歐姆龍的EE－SX770A，該型號的光電開關在擋光的情況下是工作狀態，輸出有效低電平;在通光的情況下是非工作狀態，輸出高電平。通過檢測輸出口的高低電平可以判斷光電開關的工作狀態，從而可以檢測相關機構的特定位置。檢測輸出口高低電平的電路如圖7所示，利用ARM的GPIO輸入口檢測高低電平，中間利用光耦器件將光電開關側的電路與ARM側的電路隔離開來以避免光電開關側的高電平電壓損壞ARM芯片。

圖7 光電開關和ARM連接原理圖

4 實驗結果

狹縫位置和光譜波長之間的對應關系是實現基于可變移動狹縫光譜掃描技術的基礎，因此首先進行狹縫位置標定實驗。實驗中使用汞燈及激光作為標定光波，有405 nm、435．8 nm、485 nm、546．1 nm、578 nm、638 nm共6種波長，同時接收6種光波，在CCD上觀察到6個波長點，計算各波長點在空間上的相對位置，得出的實際位置與理論波長位置存在偏差。如圖8所示，以546．1 nm波長點為坐標原點，黑線為理論波長位置，散點為三個通道的實測位置。

圖8 波長位置理論值與三通道實測值

使用三次多項式擬合，對波長位置進行修正，得到擬合波長曲線后，轉換為電機控制表，進行縫片位置控制實驗，實驗表明每個縫片對于6個波長點均可準確對心，從而實現了對于縫片位置的精確控制，其中一個縫片的位置控制如圖9所示。

通過對兩個縫片的位置進行協調控制，本文所設計的狹縫控制系統能夠自由精確地控制出射狹縫的位置與寬度。最終進行實際成像實驗，實驗使用萊卡顯微鏡自帶的樣本玻片，其含有三種熒光染料，它們分別由波長為405 nm、488 nm與638 nm的激光激發。控制三個出射狹縫，使三路通道的接收熒光波長范圍分別為410～460 nm、540～600 nm以及650～700 nm。實驗成像如圖10所示，實驗表明本文設計的狹縫控制系統能夠同時對同一樣本中不同波段的熒光成分進行成像。

圖9 縫片位置控制實驗

圖10 三路通道同時成像實驗

5 結論

本文設計的激光掃描共聚焦光譜成像狹縫控制系統，通過伺服控制的方式，利用ARM芯片控制步進電機驅動縫片運動，并由編碼器和光耦開關提供位置負反饋，可精確設置出射狹縫的中心位置與寬度，從而實現了激發熒光中不同波長成分的選擇，其中每個出射狹縫的寬度在0．04～6 mm范圍可調，調節增量為0．01 mm，通過ARM主控單元的協調，系統能夠同時對三路通道中的狹縫進行控制。縫片位置控制實驗結果表明該控制系統能夠精確控制縫片的位置，實現了波長選擇的功能;實際成像實驗結果表明該系統能夠同時對同一樣本中不同的熒光成分進行成像，提高了對于熒光樣品觀測的靈活性與觀察效果。

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