羅非魚副產物對米曲霉產酶及蛋白質轉化的影響

張紅杰 劉小玲 劉伯科 秦 溪

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004）

魚露是一種風味獨特的水產調味料，其液體清澈為琥珀色，具有獨特的鮮味，富含必需氨基酸、多種礦物元素和維生素，營養價值高［1］。泰國、越南、中國等［2］是魚露的主要生產和消費國家，中國則主要集中在東南沿海，如［3］潮汕、福州等地。魚露主要是以低值小魚蝦或水產品加工下腳料為原料［4］，經25%～30%的鹽腌漬，在自然或恒溫條件下，利用魚體自身的組織蛋白酶的酶解自溶作用，將大分子的魚體蛋白質水解成小分子的多肽、氨基酸；再在嗜鹽微生物的作用下，產生各種鮮味氨基酸及風味物質的調味醬汁，一般發酵周期在1～3年之間［5］。

醬油因其獨特的風味和豐富的營養成分，已成為中國及東亞國家重要的調味品。它主要是以大豆、小麥、麩皮為基本原料，通過米曲霉前期制曲產酶，后期加鹽加水發酵，在米曲霉分泌的蛋白酶、淀粉酶等共同作用下，使大分子的蛋白質、淀粉等營養物質，水解成小分子的多肽、氨基酸、葡萄糖等其他的營養和風味物質。

將魚露的原料—水產動物蛋白添加到傳統的醬油原料豆粕中，利用醬油釀造的菌種米曲霉的代謝產生的蛋白酶，將動植物蛋白轉化為呈味肽和其他小分子物質，縮短發酵周期［6］，獲得一種具有香甜味，沒有明顯腐臭味和魚腥味［7］，呈現顯著鮮味的復合發酵制品是本課題的目的和出發點。本研究擬探究添加羅非魚魚排進行混合制曲對米曲霉產酶能力的影響，以及魚排不同的添加方式對后續固態發酵制品品質的影響，從而為提高混合制曲酶活力，加快原料蛋白水解，提高原料利用率和增加魚醬油的品質奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

羅非魚魚排：南寧市百洋水產有限公司；

豆粕、麩皮、小麥：南寧市白蒼嶺市場；

GIM 3．451米曲霉：廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；

凱式定氮儀：KDN－04A 型，丹麥Foss公司；

電子天平：FA－1004型，瑞士Mettler Toledo公司；

自動高壓滅菌鍋：YX280A 型，上海三申醫療器械有限公司；

恒溫發酵箱：PYX－250H－C型，廣東省醫療器械廠；

分光光度計：722N 型，上海菁華科技儀器有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 菌種培養 將GIM 3．451米曲霉菌種接種到PDA試管斜面培養基，28 ℃下恒溫培養2～4d，待試管內長滿黃綠色孢子即可。再轉移到三角瓶擴培（培養條件同試管培養），得到種曲。

1．2．2 魚、豆混合制曲 豆粕、麩皮、小麥等是傳統醬油釀制的主要原料，通過前期研究得出了以豆粕為主要氮源，小麥和麩皮作為主要碳源，制曲的最佳原料配比為豆粕、麩皮、小麥按6∶3∶1添加，水添加量為原料質量的110%。本研究在不改變總體碳氮比的基礎上，通過加入魚排替代一定比例的豆粕，進行混合制曲（魚、豆混合制曲），研究魚排的加入對制曲蛋白酶活力的影響。

1．2．3 低鹽固態發酵 前期研究得出魚排經切碎、蒸煮、冷卻后加醬油曲發酵制備魚醬油（魚后期添加）的最優原料配比為成曲和魚排（濕計）按8∶4添加，水的添加量為成曲和魚排總質量的40%，醬醪鹽度為5%，發酵溫度為50 ℃。魚、豆混合制備的成曲由于水分含量較低（30%～40%），為保證相同條件下發酵，水分添加量為成曲質量的80%，其它條件與加曲發酵制備魚醬油條件相同。

根據GB 18186—2000，醬油中氨基酸態氮含量是醬油的營養價值的體現，蛋白水解率可直觀的反應出原料的利用率，總酸值為重要的滋味指標，銨鹽是醬油安全品質的一個重要體現之一。本試驗通過測定混合制曲、豆粕制曲及魚排后期醬醪中氨基酸態氮、蛋白水解率、銨鹽隨時間的變化，比較3種發酵工藝之間的差異。

1．2．4 測定方法

（1）制曲原料的化學成分測定：蛋白質和總氮的測定，參照GB 5009．5—2010；粗脂肪的測定，參照GB／T 5009．6—2003；粗淀粉的測定，參照GB／T 5009．6—2008；水分含量的測定，參照GB／T 9695．15—2008；灰分的測定，參照GB／T 5505—2008（豆粕、小麥、麩皮）和GB／T 9695．18—2008（魚排）。

（2）蛋白酶活力的測定：參照SB／T 10317—1999 的福林酚法。

根據SB／T 10317—1999的測定方法，制定的標準曲線如圖1所示，其中酪氨酸濃度與吸光值（OD660nm）的線性回歸方程：

式中：

Y——酪氨酸濃度，μg／mL；

X——吸光值（OD660nm）；

其中R2＝0．999 8，說明線性相關性良好。

圖1 蛋白酶活力標準曲線圖Figure1 Protease activity standard curve

（3）醬醪中氨基酸態氮的測定：參照GB／T 5009．39—2003中甲醛滴定法。按式（1）計算氨基酸態氮的百分含量：

式中：

PA——醬醪中氨基酸態氮的百分含量，%；

AN——醬醪中氨基酸態氮的含量，g；

M——醬醪的干重，g。

（4）蛋白水解率測定：參照何雪蓮的測定方法［8］。按式（2）計算蛋白水解率：

式中：

DH——蛋白水解率，%；

AN——發酵后醬醪中氨基酸態氮含量，g；

AN0——發酵前醬醪中氨基酸態氮含量，g；

TN——發酵前醬醪中總氮含量，g。

（5）銨鹽的測定：參照GB／T 5009．39—2003 的半微量定氮法。按式（3）計算醬醪中銨鹽的百分數：

式中：

PT——醬醪中銨鹽的百分數，%；

SN——醬醪中銨鹽的質量，g；

M——醬醪的干重，g。

1．2．5 數據分析 所有樣品進行3組平行試驗，數據采用SPSS軟件進行差異性分析（ANOVA），P＜0．05 表示存在顯著差異，使用Origin 8．0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2．1 制曲原料的基本化學組成

制曲原料的化學物質為米曲霉的生長提供必要的營養，同時也是醬油營養和風味的來源。幾種主要原料的基本組成見表1，其中豆粕粗蛋白含量最高，且價格低廉，是目前醬油發酵的主要氮源，而羅非魚魚排粗蛋白含量高達36%（干基計折算后），與豆粕蛋白質含量接近，可作為良好的氮源。小麥和麩皮淀粉含量較高，是醬油發酵的良好碳源，而且淀粉質原料是形成醬油中葡萄糖、酒精、甘油、脂類物質的主要原料等，直接影響到醬油的成色和風味；而且麩皮疏松，便于通風，有利于米曲霉生長，提高酶活。魚排的水分和油脂含量較高，如果單獨采用魚排制曲，米曲霉生長緩慢，同時也容易污染雜菌［9］。如用魚排和豆粕混合制曲，則可有望解決魚排單獨制曲的不足，同時魚排中灰分含量高，如采用混合制曲，通過后期發酵制備魚醬油，魚骨中的鈣可與產品中乳酸、氨基酸等結合，從而提高產品中的鈣離子含量。

由于羅非魚魚排水分含量高達60%，其干基蛋白質含量與豆粕相近，故后期試驗魚排添加量折算成干基量，實際濕計添加量為干基的兩倍。

2．2 魚排的替代量對米曲霉產酶活力的影響

在制備成曲過程中，米曲霉主要產生中性、堿性、酸性3種蛋白酶，但是隨著發酵的進行，醬醪pH 下降，堿性蛋白酶酶活受到抑制，本試驗選用酸性、中性蛋白酶酶活作為測定指標。

由于魚排水分含量高，不同魚排替代量，對應的水分添加量也不一樣，故在相同外界條件下進行試驗，結果見圖2。由圖2可知，隨魚排（干基）替代量逐步增加，成曲中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力都呈下降趨勢，但1／6～1／3的豆粕被魚排替代時，中性和酸性蛋白酶酶活力下降不顯著（P＜0．05）。因此魚排替代部分豆粕作為氮源，最高不應大于豆粕總量的1／3。

2．3 潤水量對米曲霉產酶活力的影響

由于羅非魚魚排的水分含量接近60%，魚排的添加使得原料的水分含量增加，外加水量下降。由圖3可知，隨著潤水量的增加，中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力都是先增加后降低，當潤水量在40%和50%時中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力達到較優值，且無明顯差異，由于高水分會抑制米曲霉的生長，容易感染雜菌，出現壞曲［9］的情況，故選擇40%的潤水量進行后期發酵制曲。

表1 制曲原料的基本化學組成Table1 Composition of starter－making raw material（n＝3，X±SD） ／%

圖2 魚排替代豆粕量對米曲霉產酶活力的影響Figure2 Effect of substitute ratio of soybean by fish ribs on the protease activity of Aspergillus oryzae

圖3 潤水量對米曲霉產酶活力的影響Figure3 Effect of water content on the protease activity of Aspergillus oryzae

2．4 米曲霉接種量對米曲霉產酶活力的影響

米曲霉接種量后于28 ℃恒溫培養72h，比較米曲霉接種量對米曲霉產酶活力的影響。由圖4可知，隨著接種量的增加，兩種蛋白酶活力均呈上升趨勢，當接種量為4×106CFU／100g時，兩種酶的酶活達到最大值。但接種量為3× 106CFU／100g和4×106CFU／100g 時，對酶活力影響無顯著差異，故選用3×106CFU／100g為最適接種量。

圖4 米曲霉接種量對米曲霉產酶活力的影響Figure4 Effect of original spores on the protease activity of Aspergillus oryzae

2．5 制曲過程中米曲霉產酶活力的變化

羅非魚排添加并部分替代豆粕制曲，對米曲霉生長和產中性蛋白酶和酸性蛋白酶有一定的抑制作用，但是魚排替代豆粕比例在1／3以內時，對中性和酸性蛋白酶活力的影響較小，同時也發現魚、豆混合制曲的潤水量為40%，接種量為3×106CFU／100g時獲得最高的酶活力。以豆粕、麩皮、小麥三者原料配比6∶3∶1，潤水量110%為對照組與魚排替代1／3豆粕量，潤水量40%，接種量3×106CFU／100g，對魚、豆混合制曲隨時間變化進行比較，測定指標為中性蛋白酶，酸性蛋白酶活力（干基）。由感官觀察發現在制曲后36h，米曲霉生長緩慢，菌絲較少，故從36h開始，每隔12h測定一次，測定結果見圖5。

圖5 中性蛋白酶活力在兩種制曲方式中隨時間的變化Figure5 Neutral protease activity changes over time of two starter－making ways

由圖5 可知，豆粕單獨制曲過程中中性蛋白酶活力在60h和72h之間無明顯差異，且達到較優值；魚豆混合制曲在72h時中性蛋白酶活力達到最大值，其中魚、豆混合制曲（1 710U／g）大于豆粕單獨制曲（1 559U／g）。

由圖6可知，豆粕單獨制曲與魚、豆混合制曲過程中酸性蛋白酶活力均在72h達到較優值，且豆粕制曲（179U／g）與魚、豆混合制曲（148U／g）相差不大。

圖6 酸性蛋白酶活力在兩種制曲方式中隨時間的變化Figure6 Acid protease activity changes over time of two starter－making ways

綜上可知，魚、豆混合制曲的最佳原料配比為魚排（干基）、豆粕、麩皮、小麥按2∶4∶3∶1進行添加，接種量為3×106CFU／100g，水分添加量為原料質量的40%，發酵時間為72h時可獲得較優中性蛋白酶（1 710U／g）和酸性蛋白酶活力（148U／g），從而為后期醬醪發酵加速底物的水解創造了條件。同時與魚排粉碎酶解后，進行液體制曲［8］相比，具有操作簡單，蛋白酶活高等優點。

2．6 魚排的兩種添加方式對蛋白水解率的影響

根據GB 18186—2000，醬油中氨基酸態氮含量是醬油的營養價值的體現，蛋白水解率可直觀的反應出原料的利用率，銨鹽是醬油安全品質的一個重要體現之一，銨鹽過高，影響人的肝、腎功能，誘發心臟病，增加患癌的危險［10，11］。本試驗以豆粕為主要氮源，進行制曲作為對照組。通過氨基酸態氮含量，蛋白水解率及銨鹽含量來比較魚排和豆粕混合制曲以豆粕制曲魚排后期添加兩種發酵工藝之間的差異。

由圖7可知，在發酵10～15d時，豆制曲醬醪（對照組）和魚、豆混合制曲醬醪中氨基酸態氮含量達到較優值，分別為2．50%（干基）和3．80%（干基）左右；魚排在發酵期添加，則醬醪中氨基酸態氮在10～15d 時達到較優值，含量為2．78%（干基）左右；魚排在成曲制備階段加入和發酵階段加入相比，前者的醬醪中氨基酸態氮比后者顯著提高，說明魚排適合在成曲制備階段添加，且魚排適當替換一定比例的豆粕，可有效增加發酵醬醪的氨基酸態氮含量。

由圖8可知，魚、豆混合制曲醬醪和豆制曲醬醪（對照組）在發酵10～15d時，蛋白水解率達到較高值分別為58%和45%左右；魚后期添加在發酵10～15d時，醬醪蛋白水解率達最大值52%；由上可知魚、豆混合制曲醬醪比魚后期添加醬醪具有更好的原料利用率。由圖5、6可知，魚、豆混合制曲和豆制曲蛋白酶活差異不大，而魚、豆混合制曲醬醪比豆制曲醬醪的蛋白水解率高，說明在同樣酶系酶活條件下魚肉蛋白比豆粕蛋白更容易水解。

圖7 3種發酵工藝中氨基酸態氮隨時間的變化Figure7 Amino acid nitrogen changes over time in the three kinds of fermentation process

圖8 3種發酵工藝中蛋白水解率隨時間的變化Figure8 Protein hydrolysis efficiency changes over time in the three kinds of fermentation process

圖9 3種發酵工藝中銨鹽隨時間的變化Figure9 Ammonium salt changes over time in the three kinds of fermentation process

由圖9可知，隨著發酵時間的推移，銨鹽先增加后減少，這是由于發酵過程中微生物的脫氨基作用及蛋白水解過程［10］中產生的小分子氨使得醬醪中銨鹽增加，隨著時間的延長，由于采用中溫發酵，在溫度較高的情況下銨鹽會分解揮發從而下降［12］。在3種發酵工藝中，豆制曲醬醪中銨鹽為最低，魚、豆混合制曲醬醪比魚排后期添加醬醪銨鹽要低，由此可知魚肉蛋白的添加會滋生腐敗菌，從而增加了銨鹽的含量，但是魚、豆混合制曲與豆制曲相差不大，是生產魚醬油比較衛生安全的一種發酵方式。然而魚排后期添加采用加曲發酵方式的醬醪銨鹽含量較高，故很多研究者進行加曲發酵時，一般采用高鹽稀態發酵的方式［8，13］，從而抑制腐敗菌的滋生。

3 結論

羅非魚魚排蛋白含量高達36%（干基計）與豆粕接近，可作為蛋白質原料制備魚露或復合發酵制品。魚排在成曲制備階段，以一定比例添加到原料中替換一部分豆粕，會影響米曲霉的生長及分泌酶的活力，但在1／3的替代率下，對米曲霉中性和酸性蛋白酶活力影響不顯著。將魚排與豆粕混合制備復合發酵制品，相同添加量下，魚排在成曲制備階段加入，經過低鹽固態發酵一段時間，其醬醪的氨基酸態氮、蛋白水解率均顯著高于純豆粕氮源醬醪的氨基酸態氮、蛋白水解率含量，而醬醪中銨鹽，雖比純豆粕的高，但顯著低于魚排后期添加的樣品。綜合比較，說明魚排添加可以有效提高發酵制品的呈味組分氨基酸態氮，且在成曲制備階段加入為宜。

1 Gustaf Helgi Hjalmarsson，Jae W Park，Kristberg Kristbergsson．Seasonal effects on the physicochemical characteristics of fish sauce made from capelin （Mallotus villosus）［J］．Food Chemistry，2007，103（2）：495～504．

2 Muhammad Zukhrufuz Zaman，Fatimah Abu Bakar，S Jinap，et al．Novel starter cultures to inhibit biogenic amines accumulation during fish sauce fermentation［J］．International Journal of Food Microbiology，2011，145（1）：84～91．

3 Jin－Jin Jiang，Qing－Xiao Zeng，Zhi－Wei Zhu，et al．Chemical and sensory changes associated Yu－lu fermentation process－a traditional chinese fish sauce［J］．Food Chemistry，2007，104（4）：1 629～1 634．

4 Wei Xu，Gang Yu，Chang－hu Xue，et al．Biochemical changes associated with fast fermentation of squid processing by－products for low salt fish sauce［J］．Food Chemistry，2008，107（4）：1 597～1 604．

5 肖宏艷，王海燕，蔡永洪，等．超聲波處理對加酶發酵魚露的影響［J］．食品與機械，2013，29（4）：14～19．

6 Chuenjit Chancharoonpong，Pao－Chuan Hsieh，Shyang－Chwen Sheu．Enzyme production and growth of Aspergillus oryzae S．on soybean Koji fermentation［J］．APCBEE Procedia，2012，2：57～61．

7 Anupam Giri，Kazufumi Osako，Akira Okamoto，et al．Olfactometric characterization of aroma active compounds in fermented fish paste in comparison with fish sauce，fermented soy paste and sauce products［J］．Food Research International，2010，43（4）：1 027～1 040．

8 何雪蓮．羅非魚加工下腳料發酵生產魚露的研究［D］．海口：華南熱帶農業大學，2007．

9 孫美琴．魚露的風味及快速發酵工藝研究［J］．現代食品科技，2006，22（4）：280～283．

10 李衛東．醬油中按鹽的形成途徑及防止辦法［J］．中國調味品，2001（8）：25～27．

11 Muhammad Zukhrufuz Zaman，Fatimah Abu Bakar，Jinap Selamat，et al．Degradation of Histamine by the halotolerant Staphylococcus Carnosus FS19isolate obtained from fish sauce［J］．Food Control，2014，40：58～63．

12 辛若竹，肖金艷，郭赫宇，釀造醬油生產過程中銨鹽含量超標的處理方法［J］．中國調味品，2006（6）：28～31．

13 Ing－Lung Shih，Lien－Guei Chen，Ton－Shi Yu，et al．Microbial reclamation of fish processing wastes for the production of fish sauce［J］．Enzyme and Microbial Technology，2003，33（2～3）：154～162．