低溫β－半乳糖苷酶分離純化及酶學性質研究

張 雪 華 霄 許 琪 楊瑞金 范宇婷

（1．江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2．云南省中小企業服務中心，云南 昆明 650000）

β－D－半乳糖苷酶（EC 3．2．1．23）具有催化乳糖中β－半乳糖苷鍵水解為葡萄糖和半乳糖及轉移半乳糖苷的活力［1］。乳品工業中，乳糖酶用于水解乳制品中的乳糖，緩解乳糖不耐受癥［2］。中國90%左右的成人有乳糖不耐癥［3］，生產提供低乳糖乳是解決乳糖不耐問題的有效途徑［4］。

乳品工業中使用的β－半乳糖苷酶多來源于微生物，利用微生物生產β－半乳糖苷酶，具有產量高、成本低、周期短等優點［5］，但目前商業β－半乳糖苷酶大多為中溫酶，最適溫度在37 ℃左右或者更高［6］，而乳品加工中許多長時間的工藝以及貯運均在低溫下進行［7］，不利于β－半乳糖苷酶活力發揮，低溫β－半乳糖苷酶在低溫下具有較高酶活，因此在乳制品加工及儲運過程中能夠高效水解乳糖，且低溫有利于抑制常溫微生物生長，提高了乳制品安全性，且在反應結束后可通過適當升高體系溫度來阻止乳糖酶的進一步反應，以保證食品風味的統一性［8］。理論研究方面，分離純化得到純酶可進行酶蛋白三級結構、低溫酶的催化反應機制及低溫酶的結構與其熱敏性關系的研究。1996年，得到第一個低溫酶的三級結構，該酶是來自南極的革蘭氏陰性菌所產的a－淀粉酶，隨后得到三級結構的低溫酶分別是鈣離子鋅離子蛋白酶、磷酸丙糖異構酶、檸檬酸合成酶、蘋果酸酶，通過這些低溫酶的三級結構研究低溫酶的低溫適應性［9］。

目前國內外研究的大多數低溫β－半乳糖苷酶產生菌為節桿 菌（arthrobacter）［10，11］和 交 替 假 單 胞 菌（Pseudoalteromonas）［12－14］。本研究中產低溫乳糖酶的耐冷菌Rahnellasp．R3屬于拉恩氏屬［15］。與劉文玉等［16］所研究的低溫乳糖酶產生 菌Rahneua aquatilis sp．14．1 屬 同 一 菌 屬，但 通 過16SrRNA 序列分析可知，這兩株菌的基因序列有較大差異［15］，是不同的菌株。

本研究擬采用硫酸銨分級沉淀、Phenyl Sepharose CL－4B疏水層析、Q Sepharose High Performance陰離子交換層析、Sephacryl S－200High Resolution凝膠過濾層析對該酶進行分離純化，通過SDS－PAGE證實得到純酶，之后對純酶進行酶學性質研究，包括最適溫度和pH，溫度和pH 穩定性，金屬離子對該酶的激活或鈍化作用，以及酶催化的米氏方程。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

陰離子交換層析填料（Q sepharose high performance）、凝膠層析填料（sephacryl S－200high resolution）、疏水層析填料（phenyl sepharose CL－4B）：美國GE Healthcare公司；

鄰硝基苯－β－D－半乳糖苷（ONPG）：國藥集團試劑有限公司；

高分子量標準蛋白：大連寶生物公司；

其他試劑未加說明均為分析純；

電腦全自動部分收集器：DBS－100型，上海滬西分析儀器廠；

電腦數顯恒流泵：DHL－A 型，上海滬西分析儀器廠；

紫外檢測器：HD－3型，上海滬西分析儀器廠；

梯度混合器：TH－300型，上海滬西分析儀器廠；

雙門層析柜：REC5004V20型，美國Revco公司；

紫外分光光度計：UV－100型，尤尼柯儀器有限公司。

1．2 菌株及培養基

菌株：產低溫乳糖酶的耐冷菌Rahnella sp．R3，本實驗室篩選并保存；

活化 培 養 基（1／4TSB）：胰 蛋 白 胨1．5%，大 豆 蛋 白胨0．5%，氯化鈉0．5%，pH （7．2±0．2）；

發酵培養基：乳糖3．0%，蛋白胨1．5%，酵母浸膏1．0%，NaCl 0．3%，pH （7．0±0．2）。

1．3 酶活力測定

吸取0．8mL 2．5g／L ONPG 于試管中，15℃預熱，添加0．2mL酶液，15 ℃恒溫反應5min，加入1mL 10% NaCO3溶液終止反應。適當稀釋于420nm 處測吸光值，空白以去離子水代替酶液［15］。酶活定義為一定條件下，1 min 水解ONPG 產生1μmol鄰硝基苯酚（ONP）所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1．4 蛋白濃度的測定

采用Bradford法［17］，以牛血清白蛋白質制作標準曲線對蛋白質濃度進行定量。

1．5 低溫乳糖酶的純化

1．5．1 菌株培養及粗酶液的制備 細菌由活化培養基活化培養24h（15 ℃，200r／min），然后按4%的接種量轉接發酵培養基，發酵培養32～34h（15 ℃，200r／min）。發酵完成后，發 酵 液 離 心10 min（4 ℃，8 000r／min），收 集 菌 體，用pH 7．1的Tris－HCl緩沖液清洗兩次，重懸后高壓細胞破碎儀進行細胞破碎，然后離心30min（4 ℃，8 500r／min），得到粗酶液。

1．5．2 硫酸銨飽和度的確定 向7個50mL的燒杯中分別加入20mL 粗酶液，按硫酸銨飽和度為10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%依次向燒杯中加入已研磨硫酸銨粉末，緩慢 攪 拌 至 溶 解，4 ℃靜 置2h，離 心30 min（4 ℃，8 500r／min），取上清液，測上清液酶活。

1．5．3 Phenyl Sepharose CL－4B 疏 水 層 析 預 先 用 加有0．8mol／L 氯 化 鈉 的20 mmol／L Tris－ HCl 緩 沖 液（pH 7．5）平衡Phenyl Sepharose CL－4B（2．6cm×40cm）疏水層析柱，流速0．8 mL／min。將硫酸銨鹽析后得到的粗酶液經0．22μm 的微孔濾膜后，15 mL 上樣Phenyl Sepharose CL－4B（2．6cm×40cm）疏水層析柱，用含有0．8mol／L氯化鈉的pH 7．5，20 mmol／L 的Tris－HCl緩沖液洗脫，待OD280 值低于0．05時，使用不含鹽的20 mmol／L 的Tris－HCl緩沖液（pH 7．5）洗脫，收集并檢測酶活力，收集有酶活的部分。

1．5．4 Q Sepharose High Performance離子交換層析 預先用加有0．3 mol／L 氯化鈉的20 mmol／L Tris－HCl緩沖液（pH 7．1）平衡Q Sepharose High Performance（2．6cm×15cm）陰離子交換層析柱，流速1 mL／min。將通過Phenyl Sepharose CL－4B收集到 的 有 酶 活 的30 mL 上 樣Q Sepharose High Performance 陰 離 子 交 換 層 析，先 用 加 有0．3mol／L氯化鈉的20mmol／LTris－HCl緩沖液（pH 7．1）以相同的流速洗脫，待OD280低于0．05時，再用加有0．3～0．8mol／L氯化鈉的20mmol／L Tris－HCl（pH 7．1）緩沖液線性梯度洗脫，收集并檢測酶活力，收集有酶活的部分。

1．5．5 Sephacryl S－200High Resolution凝膠過濾層析 預先用20mmol／L的Tris－HCl緩沖液（pH 7．1）平衡Sephacryl S－200 High Resolution（1．6cm×100cm）凝膠過濾層析柱，流速0．5 mL／min。將離子交換層析得到的有酶活的部分15mL濃縮到3mL后經0．22μm 的微孔濾膜，上樣 到 Sephacryl S－200 High Resolution 凝 膠 過 濾 層析，20mmol／L的Tris－HCl緩沖液（pH 7．1）洗脫，收集并檢測酶活力，收集有酶活的部分。以上所有操作均在4 ℃層析柜中進行。

1．5．6 純度鑒定和分子量測定 按Laemmli等的方法［18］進行SDS－PAGE，采用分離膠濃度為7．5%，濃縮膠濃度為5%，將樣品和標準蛋白（高分子量標準200，116，97．2，66．4，44．3kDa）進行SDS－PAGE，然后通過凝膠成像分析軟件Image lab 3．0計算酶的表觀分子量。

1．6 酶學性質的研究

1．6．1 酶的最適反應溫度及熱穩定性研究 選取4，15，25，35，45，55，65 ℃7個反應溫度，測定酶活，考察不同反應溫度對酶活性的影響。根據溫度對酶活力的影響選取4，15，25，35，45 ℃5個溫度，保溫，每隔15 min測一次酶活，考察酶的熱穩定性。

1．6．2 酶的最適pH 及pH 穩定性研究 選取pH 5．0，5．5，6．0，6．5，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，在各個pH 條件下測定酶活，考察pH 對 酶活性影 響。在25 ℃、pH 5．0，5．5，6．0，6．5，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0維持24h，測定酶活，考察pH 的穩定性。

1.勞動力資源短缺。“平成景氣” 使得日本經濟對勞動力的供需矛盾進一步凸顯，日本在1988年的有效求人倍率開始大于1，并不斷增加。1989年，日本制造業勞動力的供需矛盾在質與量上均呈現供給不足，技術人才短缺成為主要矛盾。根據《日本工業新聞》的一項調查統計：日本電氣電子行業、信息通信行業、機械制造行業的技術人員嚴重短缺。被調查的企業中，超過50%的機械制造行業表示技術人員嚴重不足；汽車制造、船舶制造和建筑行業表示技術人員缺乏的比例為54%；69%的基礎材料企業表示五年后將出現嚴重的技術人才短缺。

1．6．3 金屬離子對酶活性的影響 選取Na＋、Mg2＋、K＋、Ca2＋、Cu2＋、Al3＋、Zn2＋7 種 金 屬 離 子，離 子 濃 度 均 為5mmol／L，考察這7種金屬離子對酶活性的影響。

1．6．4 酶反應動力學的研究 以不同濃度的ONPG 為底物，以Tris－HCl為緩沖液（pH 7．1），在25 ℃測不同濃度底物的反應速率。以底物濃度的倒數1／［S］為橫坐標，以反應速率的倒數1／V 為縱坐標，作圖，得到Km、Vmax的值。

2 結果與分析

2．1 鹽析

硫酸銨分級沉淀結果見圖1。由圖1可知，在20%飽和度時，上清液中的酶活力很高，在硫酸銨飽和度40%以上時，上清液中的酶活很弱。綜合考慮酶的純化倍數和回收率，選擇20%～40%飽和度進行硫酸銨分級沉淀，將得到的沉淀用20mmol的Tris－HCl緩沖液（pH 7．5）重溶。

圖1 鹽析曲線Figure1 Salting－out curve

圖2 Phenyl Sepharose CL－4B疏水層析Figure2 Phenyl Sepharose CL－4Bhydrophobic interaction chromatography

圖3 Q Sepharose High Performance陰離子交換層析Figure3 Q Sepharose High Performance anion exchange chromatography

2．2 Phenyl Sepharose CL－4B疏水層析的結果

Phenyl Sepharose CL－4B洗脫曲線見圖2。由圖2可知，分離得到3個較大的蛋白峰，收集后酶活性檢測到第3個蛋白峰有酶活性，酶活峰與蛋白峰重合。酶活出峰位置出現在低鹽洗脫階段，說明目標蛋白疏水性較強。從洗脫曲線來看，疏水層析效率較高，除去了大量的雜蛋白。

2．3 Q Sepharose High Performance陰離子交換層析

Q Sepharose High Performance陰離子交換層析洗脫曲線見圖3。由圖3可知，圖中出現2個峰，收集后酶活性檢測到第2個峰有酶活，根據線性洗脫曲線顯示，第2個峰出峰位置出現在NaCl濃度為0．45～0．60mol／L處。酶活峰與蛋白峰重合，酶活峰比較集中，離子交換層析去除一部分雜蛋白。

2．4 Sephacryl S－200High Resolution凝膠過濾層析結果

Sephacryl S－2 0 0High Resolution凝 膠 過 濾 層 析 結 果見圖4。由圖4可知，凝膠過濾層析出現2個峰，經酶活性檢測到第2個峰有酶活性，酶活曲線與蛋白曲線重合，酶活峰比較集中，凝膠過濾層析的純化效率較高。

2．5 酶的純化結果

由表1可知，經過4 步純化最終得到純化倍數為35．6的低溫乳糖酶，得率為21．3%。

2．6 相對分子量的測定

純化后的酶液，通過SDS－PAGE 分析，得到單一條帶見圖5。由圖5可知，得到的低溫乳糖酶已經達到電泳純。SDS－PAGE通過凝膠成像分析軟件Image lab 3．0計算得表觀分子量為57．3kDa。

圖4 Sephacryl S－200High Resolution凝膠過濾層析Figure4 Sephacryl S－200High Resolution gel filtration chromatography

表1 Rahnella sp．R3的低溫β－半乳糖苷酶分離純化Table1 The purification of a new cold－adapted lactase fromRahnella sp．R3

圖5 純化的低溫β－半乳糖苷酶SDS－PAGE圖Figure5 SDS－PAGE pattern of purifiedβ－galactosidase

2．7 低溫乳糖酶酶學性質

2．7．1 酶的最適反應溫度及熱穩定性 在pH 7．5條件下，4～65 ℃測定酶活力與溫度的關系。由圖6可知，作用溫度為45 ℃時該酶具有最高酶活，故確定該酶的最適作用溫度為45℃；15℃下的酶活為最高酶活的40%，4℃下是最高酶活的23%。由圖7可知，該酶對熱敏感，45℃保溫45min酶活幾乎全部喪失。在4，15，25 ℃溫度下保溫90min，酶活保留率均在90%以上，說明該酶在4，15，25 ℃溫度下穩定性較好。

圖6 溫度對酶活性的影響Figure6 Effect of temperature on enzyme activity

圖7 溫度對酶穩定性的影響Figure7 Effect of temperature on the stability of enzyme

圖8 pH 對酶活性的影響Figure8 Effect of pH on enzyme activity

圖9 pH 對酶穩定性的影響Figure9 Effect of pH on the stability of enzyme

2．7．2 酶的最適pH 及pH 的穩定性 由圖8可知，該酶在pH 6．5～7．5時酶的活性較高，該酶的最適pH 為7．0。由圖9可知，在25 ℃、pH 6．5～7．5維持24h，酶活保持86%以上，即在pH 6．5～7．5時該酶具有較高的穩定性。

2．7．3 金屬離子對酶活力的影響 由圖10可知，5mmol／L Na＋、Ca2＋、Cu2＋、Al3＋、Zn2＋對酶活力有不同程度的抑制作用，其中Al3＋抑制作用最強，Na＋、Ca2＋抑制作用不明顯。5mmol／L Mg2＋、K＋對酶活力具有促進作用，其中Mg2＋促進作用較強，使其酶活提高到1．19倍。

圖10 金屬離子對酶活性的影響Figure10 Effect of metal ions on enzyme activity

2．7．4 動力學Km值及Vmax的測定 以不同濃度的ONPG為底物，以Tris－HCl為緩沖液（pH 7．1），在25 ℃測不同濃度底物時的反應速率。以底物濃度的倒數1／［S］為橫坐標，以反應速率的倒數1／V 為縱坐標作圖見圖11，計算得Km值為4．64mmol／L，Vmax為7．19mol／（min·mL）。

圖11 純化的低溫β－半乳糖苷酶的Lineweaver－Burk 圖Figure11 Lineweaver－Burk pattern of purified β－galactosidase

3 結論

產低溫乳糖酶的耐冷菌Rahnella sp．R3是從天山凍土中篩選得到的一株野生菌，且所產的胞內低溫乳糖酶的酶量很低，通過四步純化步驟純化得到低溫乳糖酶。低溫酶在高溫下很難保持酶活，整個純化過程均在4 ℃層析柜中進行，最終得到純化倍數35．6%，產率21．3%。通過SDS－PAGE電泳分析，顯示為單帶，表觀分子量為57．3kDa。對酶學性質的研究表明，該酶酶活在pH 6．5～7．5范圍內保持穩定，且Ca2＋對于酶活的抑制作用不明顯，這為該酶在乳制品中應用提供了條件。然而野生菌中酶產量較低，可通過構建工程菌手段來提高產量。而該酶的基因序列未知，需通過純化得到純酶后進行氨基酸序列測定，利用氨基酸序列設計引物，再結合分子手段可以得到編碼該酶的基因序列，為后期分子工作的開展和低溫乳糖酶的大規模生產提供了條件。

目前，國內外研究的大多數低溫β－半乳糖苷酶產生菌為節桿菌（arthrobacter）［10，11］和交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）［12－14］。本研究中產低溫乳糖酶的耐冷菌Rahnella sp．R3屬于拉恩氏屬［15］，純化所得到的酶與新疆石河子大學從新疆低溫環境分離篩選到的低溫乳糖酶產生菌Rahneua aquatilis sp．14．1［16］進 行 比 較，發 現 該 酶 的 純 化 倍 數為35．6，明顯高于其純化倍數4．19，取得了更好的純化效果。SDS－PAGE電泳結果顯示表觀分子量為57．3kDa，不同于其表觀分子量60kDa。在酶學性質方面，該酶最適反應溫度為45 ℃，45 ℃保溫45 min酶活全部喪失，純酶最適反應pH 值為6．5～7．5，Rahneua aquatilis sp．14．1所產的低溫乳糖酶，酶的最適反應溫度為35 ℃，45 ℃保溫2h，酶完全失去活力，最適反應pH 值為6．5～7．0均有所不同。

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