天然活性小分子物質分離技術研究

姜 麗

(安徽理工大學，安徽淮南232000)

豐富多樣的植物、動物資源是大自然對我們的饋贈。從天然植物、動物資源中尋找利于人們身體健康的保健品和新型藥品是現代植物化學的主要研究方向之一。據資料報道，在天然植物中具有藥理活性的化合物分子量基本在1 000 Da以下。如何將活性成分分離并鑒定其結構則是進一步開展研究的基礎。天然產物活性小分子物質的分離可分為經典方法和色譜分離方法，其中經典方法是色譜技術的基礎。

1 經典方法

1.1 LLE法 化合物的化學結構復雜多變。大分子物質如多糖的化學結構解析依然是多糖研究中的難點，并且通過現代波譜學方法僅能解析出多糖大分子復雜結構中的重復單元結構。小分子物質如生物堿，不同類型的生物堿具有不同的母核結構，相同的母核結構又由于取代基或構象不同而千差萬別。因此，分子中的原子處于不同的化學環境中，使得天然化合物分子極性各異。根據這一特點，采用液相萃取法可以快速、準確地將所需化合物按照極性大小劃段。相同的分離段中的化合物具有相同的極性，為進一步分離、純化奠定基礎。

液相萃取(LLE)需要使用大量的有機溶劑，具有對環境不友好等缺點。近年來，出現了一種新型液相微萃取技術——濁點萃取法。濁點萃取原理是基于中性表面活性劑膠束溶液的濁點現象，通過改變試驗條件如溶液pH、離子強度、溫度等使得疏水性物質和親水性物質產生相分離［1－2］。這種方法安全高效、綠色環保，在很多領域已得到廣泛應用。

1.2 SPE法 固相萃取(SPE)是利用固體吸附劑吸附混合液中目標化合物，再利用洗脫液將其洗脫下來，達到分離、富集目標物的一種手段。近年來，發展較快的新方法有基于萃取涂層與樣品之間的吸附—溶解—解吸平衡而建立起來的集進樣、萃取、濃縮功能于一體的固相微萃取技術(SPME)［3］;萃取原理與 SPME 一致，將聚二甲基硅氧烷(PDMS)套在內封磁芯的玻璃管上作為萃取涂層的攪拌棒吸附萃取(SBSE)［4］;分子印跡固相萃取技術(MISPE)是使用人工合成的聚合物作為分子印跡聚合物，利用其對特定分子具有特異選擇性來提高萃取選擇性，該聚合物簡單經濟，對熱、有機溶劑、強酸、強堿等都比較穩定［5］;免疫親和固相萃取(IASPE)是將醫學免疫與色譜技術融合，利用抗原抗體相互高度識別的特點將目標化合物分離、濃縮。這種分離技術尤其適用于生物活性小分子的分離識別，如海洛因和嗎啡等生物堿類化合物［6－7］。

1.3 膜分離法 膜分離法的基本原理類似于“分子篩”，通過調整膜孔徑大小可分離不同分子大小的有機化合物，根據膜孔徑可將膜分離為超濾和納濾。膜分離技術不使用有機溶劑，操作過程中化學環境溫和環保，故在天然活性產物的分離篩選上將會得到更加廣泛的應用［8］。

1.4 沉淀法 沉淀法是利用有機化合物在溶劑中的溶解特點進行分離的一種方法。最典型的應用為采取水提醇沉法提取大分子多糖和蛋白質。這種方法操作簡單，過程溫和，環境友好，成本低廉，且適合處理大量樣品，目前已被廣泛使用。

2 色譜分離方法

色譜方法根據分離機制可分為吸附色譜、分配色譜、體積排阻色譜、離子交換色譜、親和色譜、化學鍵合相色譜、毛細管電色譜和毛細管電泳［9］，其中親和色譜主要用于分離純化蛋白質等生物大分子生化樣品，而毛細管電泳法在生命科學中應用廣泛。天然產物化學中生物小分子分離主要使用的有MG大孔樹脂、Sephadexlh20、rp-8和正相硅膠色譜等。

2.1 大孔樹脂 大孔樹脂是人工合成的高分子化合物。它不溶于酸、堿或有機溶劑且對熱穩定，可有效地對有機化合物進行濃縮、分離。影響其吸附、分離效果的因素主要有樹脂結構、化合物結構和洗脫劑。在天然產物的分離提取中，大孔樹脂主要用來對化合物的極性、大小進行劃段，為后續分離、純化工作做準備。

2.2 凝膠色譜 凝膠色譜本質上是一種體積排阻色譜。它具有“分子篩”功能，其網狀結構使得小分子物質可以進入凝膠內部而大分子物質被排阻開來。在凝膠色譜中，Sephadexlh20在生物小分子分離純化中具有舉足輕重的地位。對于Sephadexlh20，相對分子質量大于5 000的生物分子將隨流動相直接流出而不被色譜柱保留，且這種凝膠不受溶劑系統限制，所以它特別適合生物堿、聯芐類、菲類、萜類等小分子活性物質的分離制備，既可以用作初步劃段又可以用作最終的精制測定。

2.3 硅膠色譜 硅膠色譜不溶于任何溶劑，化學性質穩定，除強堿、氫氟酸外與任何物質均成惰性，常用的規格有100～300目，目數不同，上樣量也不同，并且目數越細，上樣量越大，流速越小，但是耗費時間較長。由于硅膠柱具有死吸附的特點，在使用過程中要注意把握時間和規格，以防止微量活性物質損耗過大而分離不出來。

3 展望

在許多植物與中草藥中陸續發現眾多具有抗氧化、抗腫瘤、細胞毒性和保護神經系統藥理功效的小分子化合物如萜類和聯芐類。如何采用物理、化學、物理化學相結合、色譜等現代分離純化方法將它們溫和地提取分離出來是現代新藥開發的基礎，也是新型保健品研制的關鍵點。安全高效、快速溫和的預處理技術如微萃取和物美價廉、環保高效的色譜技術如凝膠色譜將是天然活性小分子物質分離技術的主要研究方向。

［1］吳昊.液相萃取新方法的建立和應用［D］.臨汾:山西師范大學，2012.

［2］王堅剛，林建原.濁點萃取技術的應用［J］.廣東微量元素科學，2009，16(3):17－20.

［3］馬繼平，王涵文，等.固相微萃取新技術［J］.色譜，2002，20(1):16 －20.

［4］許志剛，胡玉玲.攪拌棒吸附萃取技術的研究進展［J］.分析化學評述與進展，2011，39(11):1766 －1773.

［5］蔡亞岐，牟世芬.分子印跡固相萃取及其應用［J］.分析測試學報，2005，24(5):116－121.

［6］許莉.利用免疫親和固相萃取檢測小分子化合物的方法研究及其應用［D］.北京:北京大學，2010.

［7］孫海紅，錢葉苗，等.固相萃取技術的應用與研究新進展［J］.現代化工，2011，31(2):21 －24.

［8］徐任生，趙維民，葉陽.天然產物活性成分分離［M］.北京:科學出版社，2012.

［9］杜斌，鄭鵬武.實用現代色譜技術［M］.鄭州:鄭州大學出版社，2009.