基于微通道電化學傳感器的牛奶體細胞定量檢測方法研究

張學超 陳至坤 崔傳金 （河北聯合大學電氣工程學院 河北 唐山 063000）

奶牛乳腺炎(Cow Mastitis)是指奶牛乳腺組織由病原微生物感染所引起的炎癥反應，是奶牛所有疾病中發病率最高，危害最為嚴重的一種疾病，美國每年因奶牛乳腺炎造成的經濟損失高達20億美元[1,2]。中國每年的牛奶產量為3555.8萬t[3]，而中國廣東氣候炎熱潮濕，奶牛的隱性乳腺炎平均月發病率為30%，季度平均發病時間為13%，受感染的奶牛平均感染時間為兩個季度，所以控制奶牛隱性乳腺炎的發病率顯得尤為重要[4]。

新鮮牛奶中的體細胞數量(SCC)與奶牛乳腺炎[5,6]、牛奶質量密切相關。不同患病程度的乳腺炎奶牛，其體細胞數量不同、細胞大小百分比也不同[7]。體細胞含量已經作為許多國家監控牛群健康狀況、牛奶質量和牛奶定價收購的重要指標[8]。因此，如何實現牛奶中體細胞的準確、快速、在線檢測具有重要意義。

傳統體細胞數檢測存在檢測時間長、操作復雜、成本高和不能在線檢測的問題[2,9]，而使用電參數檢測法來檢測體細胞數量，并與美國加州牛乳腺檢測方法(California Mastitis Test, CMT)[10]相對比，來間接判斷奶牛乳腺炎患病程度、牛奶質量，是未來乳品檢測行業發展的主流方向，而電檢測方法具有快捷方便的特點和在線檢測的應用前景[9]。

在電導率檢測乳腺炎中，溫度對牛奶的電導率影響很大[11]。但是，目前從細胞電容的角度研究電容值、細胞含量和細胞大小百分比之間關系的文章比較少。Xiong Z Q[12]等研究了在發酵過程中，發現生物量與電容值之間的關系之間存在線性關系和Shramik Sengupta[13]等研究了大腸桿菌在培養基上生長代謝的情況，發現微生物數量與電容值之間也存在線性關系。這都是因為微生物、細胞的表層是不導電的原生質膜結構[14]。當具有完整膜結構的微生物處于電場中時，在電場力作用下微生物會表現出微小電容效應，微生物含量與電容值呈正相關[13,15]。

本文通過微通道電化學傳感器測取不同細胞含量新鮮奶樣的電容值，用電容、溫度和細胞大小百分比3參數建立預測體細胞含量的神經網絡模型，以其達到準確、快速、在線診斷奶牛乳腺炎和評判牛奶質量的目的。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

日本HIOKI3532-50 LCR測試儀、BCD-219SKDE冷藏柜、高精度溫度計(精度為0.001℃)、培英THZ-C恒溫振蕩器、奧林巴斯CX21生物光學顯微鏡等。主要數據分析處理采用Matlab7.3軟件。

1.2 試驗方法

1.2.1 奶樣采集 奶樣采自100多頭正常生理期[11]的同一品種黑白花奶牛。采樣時先用溫開水擦拭乳頭，然后用75%的酒精對乳頭進行消毒，并用醫用棉簽擦干，棄去前兩次擠出的牛奶，再進行奶樣采集。每個乳區的牛奶分別擠入50ml干凈的帶有編號玻璃瓶內密封。在運輸過程中放入裝有冰袋的隔熱泡沫塑料盒內進行保鮮。最后將當天采集到的奶樣帶回實驗室測試，來不及馬上測試的奶樣需4℃冷藏保存，防止牛奶變質影響測試。

1.2.2 細胞含量測定 牛奶中體細胞含量的測定采用改進的顯微鏡直接計數法。奶樣取回后，將裝有奶樣的奶樣瓶放入恒溫振蕩器中，在40℃的恒溫水浴鍋中震蕩15min后取出[16]，使得細胞均勻地懸浮在牛奶中，同時配置碘酊染液：每毫升生理鹽水中滴加質量分數為2%的碘酊3滴，混勻即可，現用現配。再用移液槍吸取0.1ml的奶樣注入編號試管內，再用移液槍吸取1.9ml碘酊染液注入試管內，輕輕搖動，混合均勻，靜置3～5min。最后用移液槍吸取少量染色后的奶樣(約半滴)輕輕接觸蓋玻片和計數板的結合處，讓其自動流入并充滿計算室，然后進行顯微鏡計數，在目物鏡15×40的放大倍數下，將計算室四角4個大方格內的全部體細胞按順序計數；調節顯微鏡倍數，計算不同直徑范圍內的細胞占細胞總數的百分比。為避免重復和遺漏，采用“數上不數下，數左不數右”的計數原則，即對壓在方格左邊和上邊線上的體細胞計在本格內。最后，牛奶體細胞含量按公式計算：SCC=T×5 ×104(1)。式中：SCC―牛奶中每毫升的體細胞含量(個/ml)；T―4個大方格內的體細胞數目之和。

試驗中，同一奶樣重復鏡檢計數4次，取其平均值作為奶樣體細胞含量，并記錄不同直徑范圍內的細胞占細胞總數的百分比，見表1。共測取了80份奶樣，并根據細胞含量和加利福尼亞CMT標準[17]，將奶樣劃分到5個不同的等級，見表2。

表1 新鮮牛奶樣品中細胞大小的百分比 (萬個/ml，mm)

表2 CMT法檢測奶牛乳腺炎的標準

1.2.3 牛奶電容測量 因為溫度對測量牛奶電容值的影響較大，所以測量過程中需記錄并保持被測奶樣溫度。使用HIOKI 3532-50 LCR測試儀測量并記錄奶樣電容值。為避免測試奶樣之間的交叉污染，每測完一個奶樣后，注射器和傳感器都必須用蒸餾水清洗干凈，并用一定量的下一個奶樣沖洗3次，在進行該奶樣的測試。所有的奶樣都在采集后的12h內全部測試完畢。

2 微通道電化學傳感器的設計

電極材料采用99.99%的高純度鉑金材料，購于天津艾達恒晟科技發展有限公司。電極體材料和微通道管體材料采用透明、絕緣性好的聚四氟乙烯材質。電極引線采用銅質屏蔽線。為突出容抗的作用，根據Xc=1/(c)= 1/(2fc)（2）式中：Xc—容抗、c—電容、—電極兩端激勵源信號角頻率、f—激勵源信號頻率。在激勵源信號頻率一定的情況下，要想得到較高的容抗，根據c=A/L(3)式中：—電容率、L—電極間距離、A—電極橫截面積。正是從減小電極橫截面積和增加傳感器長度兩方面來增加容抗，所以設計了微通道電化學傳感器。

3 細胞含量神經網絡預測模型

BP(Back Propagation)算法是目前應用最為廣泛的神經網絡學習算法，可實現輸入和輸出間的任意非線性映射，具有一定的泛化功能[18]。將奶樣的電容、溫度和細胞大小百分比3個向量作為網絡的輸入，輸入層神經元數為3。網絡的輸出向量為體細胞數，輸出層神經元數為1。該網絡采用了2個隱層。兩隱層之間傳遞函數為Tansig，輸出層函數為Purelin，訓練函數選用trainlm。在網絡訓練前，將數據用mapstd()標準化函數進行了標準化預處理，以避免數據飽和并加速網絡的收斂速度。

通過調整隱層的節點數和相關的訓練參數對網絡結構進行了優化試驗。經過多次的訓練仿真，發現當最大迭代次數為10000，誤差性能目標值為0.1。網絡模型的兩隱層神經元數為6和4時結果較為滿意，模型結構為3-6-4-1，如圖1所示。

圖1 模型網絡結構

3.1 模型分析

模型的評價指標和預測結果分別見圖2、3和表3、4。由表3可知，模型的相關性很高，相關系數R達到了0.9916，模型均方根誤差RMSE為6.3094；預測集的預測相關系數Rp也達到了0.9963；預測均方根誤差RMSEp為10.2916。由圖2可以看出，模型的擬合效果比較滿意，決定系數也較高，R2為0.9833。因此說明所建立的奶牛乳腺炎的檢測模型基本可靠。

圖2 模型輸出值與實際值線性回歸圖

圖3 模型預測輸出值與實際值線性回歸圖

表3 模型評價參數

表4 各級正確檢出率

3.2 模型預測結果與分析

由圖3可以看出，模型的預測決定系數R2為0.9926。表3中，模型對9個剩余奶樣進行建模預測，正確預測檢出率為89.58%；80個奶樣的總體檢出率為78.8%與S.Ankinakatte[19]等研究的用神經網絡檢測乳腺炎的靈敏度75%基本吻合。N級和T級正確檢出率偏低，分別為73.56%和65.78%。但是1級和2級正確檢出率明顯提高，分別達到89.03%和94.32%。原因很可能是由于體細胞含量，在N級和T級中，細胞含量總體上比較低，所產生的電容信息比較少，而極化產生的界面電容占總電容比重較大[13]，因此，測取的電容值不能很好地反映低濃度細胞含量，最終導致N、T級的檢出率偏低。另外，T級正確檢出率略低于N級，可能是T級的奶樣數目較少所致。1級和2級的正確檢出率較高，可能是體細胞的濃度較高，細胞極化電容占總電容比重升高，這時所測電容值就能很好地反映體細胞含量，細胞含量越高，這種關系就越顯著，而2級中的奶樣體細胞含量不低于120萬/ml，所以正確檢出率就達到了94.32%。

4 結論

通過使用微通道電化學傳感器來檢測牛奶體細胞電容值，結果表明：電容值、溫度和和細胞大小百分比與體細胞含量之間有著密切關系，細胞含量越高，檢測效果越好。但在較低細胞含量下關系并不明顯，這是因為界面極化電容淹沒了有用的奶體電容。所以，從減小界面電容著手，深入研究微通道電化學傳感器結構，提高傳感器檢測精度一個重要的研究課題。

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