金黃地鼠胰腺癌動物模型的建立

馬青松，張小明，沈成義，吳澤珊，蒲 宇，武超穎，楊正偉

(1．資陽市第一人民醫(yī)院放射科，四川 資陽 641300；2.醫(yī)學(xué)影像四川省重點實驗室·川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，四川 南充 637000；4.川北醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，四川 南充 637000； 5.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放射科，四川 瀘州 646000)

胰腺癌是常見的惡性腫瘤，惡性程度較高、發(fā)展快、預(yù)后差，目前尚無有效的篩查或早期診斷方法。據(jù)統(tǒng)計，美國每年有30 000多人死于胰腺癌，居癌癥死亡第4位[1-2]。理想的胰腺癌動物模型為研究胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及其細(xì)胞、病理、分子生物學(xué)特性，及探討其診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。通過給敘利亞金黃地鼠皮下注射化學(xué)物質(zhì)N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺[N-Nitrosobis(2-oxopropyl)amine，BOP]，成功建立了化學(xué)誘導(dǎo)型胰腺癌動物模型，目前國內(nèi)尚未見報道，現(xiàn)總結(jié)并報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

敘利亞金黃地鼠120只，由四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場提供，品系為敘利亞種，合格證編號：0016952，鼠齡為8周，平均體重100 g，雌性。將實驗動物隨機分為實驗組(80只)、對照組(40只)，飼養(yǎng)在恒溫(21+5)℃、恒濕(70+10)%、符合SPF條件的本院動物實驗室內(nèi)，每籠2～3只?；\具、墊料經(jīng)紫外線消毒，食物、飲用水經(jīng)高壓滅菌供動物自由食用。食物為小鼠專用壓縮顆粒飼料。試劑：BOP(產(chǎn)品代碼 3525623-1G，Ash Stevens Chemical Co.，USA)。

1.2 模型建立

稱取金黃地鼠重量，將BOP溶于0.9% 生理鹽水溶液(1 mg BOP/mL生理鹽水)。用2.5 mL無菌注射器吸取配制好的BOP溶液，以30°角進(jìn)針，行實驗組金黃地鼠背部中線部位皮下注射，注射劑量為10 mg BOP/kg體重。每周1次，持續(xù)7周。對照組皮下注射0.9%生理鹽水溶液。每天觀察動物基本情況，每周定時測量1次體重，記錄每周食物攝入量及飲水量。

1.3 病理組織學(xué)檢查

第1次注射后第11周開始，每兩周1次，脫臼法隨機處死實驗組金黃地鼠10只，對照組5只；如有意外死亡的，即時解剖，并計入該周處死量。記錄胰腺的肉眼觀察結(jié)果，完整取下胰腺及胰腺腫瘤，電子稱稱取腫瘤重量，根據(jù)公式V=a2×b/2計算腫瘤體積[3]，a代表腫瘤短徑，b代表長徑，單位為mm。用Bouin液固定，石蠟分別包埋肉眼所見胰腺腫瘤及胰腺組織，常規(guī)切片、HE染色，由病理科醫(yī)師對所有切片進(jìn)行組織學(xué)觀察，行組織病理學(xué)診斷。以只為單位，記錄觀察結(jié)果。依據(jù)Konishi等[4]和Tsutsumi等[5]的方法，將BOP誘導(dǎo)的胰腺病變按進(jìn)展過程分為不典型導(dǎo)管增生(atypical ductal hyperplasia，ATH)、原位癌(carcinoma in situ，CIS)、浸潤癌(invasive carcinoma，CA)三類。即：ATH主要表現(xiàn)為導(dǎo)管(小管)擴(kuò)張，導(dǎo)管上皮由一層以上細(xì)胞構(gòu)成，伴多形核，被認(rèn)為是癌前病變；CA表現(xiàn)為不規(guī)則的發(fā)育異常的小管伴浸潤生長，絕大多數(shù)伴有特征性炎性反應(yīng)及纖維組織增生；CIS則表現(xiàn)為腺泡周圍局部浸潤，沒有纖維組織增生。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實驗動物基本情況

實驗組與對照組金黃地鼠飲水量在第1～4周均不足150 mL/周，之后逐漸增加，最大飲水量220 mL/周，兩組動物飲水量及食物攝取量差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗組平均體重輕于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。17周后部分動物出現(xiàn)黃疸，表現(xiàn)為不同程度的鞏膜、唇周、四肢皮毛裸露部皮膚黃染。

2.2 BOP誘導(dǎo)性金黃地鼠胰腺病灶肉眼發(fā)現(xiàn)

實驗組在18只金黃地鼠中發(fā)現(xiàn)23個胰腺腫瘤。其中，1只發(fā)現(xiàn)3個胰腺腫瘤，3只發(fā)現(xiàn)2個，其余均為單發(fā)。其中，7個腫瘤直徑<5 mm，16個腫瘤直徑≥5 mm，最小腫瘤直徑2.0 mm，最大腫瘤直徑17.0 mm。腫瘤直徑中位數(shù)6.8 mm，體積中位數(shù)178.7 mm3，質(zhì)量中位數(shù)0.32 g。最早于第1次注射BOP后15周發(fā)現(xiàn)胰腺結(jié)節(jié)(圖1為Bouin氏液固定后)。多數(shù)腫瘤呈粉紅或肉紅色，部分腫瘤為紅白相間色。部分腫瘤表面不規(guī)整，略呈分葉狀。剖開腫瘤，可見出血及壞死灶。腫瘤較大時與周圍組織結(jié)構(gòu)分界不清，不易剝離。

2.3 病理組織學(xué)檢查

將BOP誘導(dǎo)的胰腺病變按先前介紹的方法分為ATH、CIS、CA三類(圖2)，其病理組織學(xué)發(fā)現(xiàn)見表1。第1次注射BOP后11周，即在10只實驗鼠中發(fā)現(xiàn)5只胰腺具有不同程度的ATH，共在65只實驗鼠中發(fā)現(xiàn)ATH。最早于第1次注射BOP后13周發(fā)現(xiàn)CIS，共在9只鼠中發(fā)現(xiàn)9個CIS；最早于第19周發(fā)現(xiàn)CA，實驗組共在17只動物中發(fā)現(xiàn)22個CA。19周后，所有的實驗組動物均發(fā)現(xiàn)ATH。鏡檢發(fā)現(xiàn)的所有CIS及CA均為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinomas，PDAs)。肉眼發(fā)現(xiàn)的23個腫瘤中，20個為CA，3個為CIS；肉眼未能發(fā)現(xiàn)的8個PDAs中2個為CA；6個為CIS。實驗組總成瘤率(ATH、CIS、CA三類病灶)81.3%(65/80)。第1次注射BOP 11周后不同時間段CIS發(fā)現(xiàn)數(shù)量沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。將17周前后ATH、CA發(fā)現(xiàn)病例數(shù)分別合并，行Fisher確切概率檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。對照組發(fā)現(xiàn)1個胰腺腫瘤，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 不同時間點BOP誘導(dǎo)金黃地鼠胰腺病變病理發(fā)現(xiàn)

注：*Fisher確切概率檢驗；△ATH組及CA組將17周前后病例數(shù)分別合并。

3 討論

理想胰腺癌動物模型應(yīng)具備的條件[6]：①保留原發(fā)腫瘤生物學(xué)特性，癌腫形成過程與人胰腺癌自然發(fā)生過程相似，腫瘤酶學(xué)反應(yīng)陽性。②具有客觀而量化的指標(biāo)，實驗動物的大小、體重、壽命等適合實驗。③實驗方法簡便易行，對人體無害或危害較少，對環(huán)境污染少；周期短，制備的模型具有可靠性、可重復(fù)性、有效性及實用性。④可對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞和分子現(xiàn)象進(jìn)行研究。

目前，常見的胰腺癌動物模型包括化學(xué)誘導(dǎo)型、種植型及基因工程型[7-11]，三者各有優(yōu)缺點。其中，異位種植性胰腺癌動物模型受到位置特異性影響，與人的胰腺癌自然病程不一致；原位種植性胰腺癌動物模型技術(shù)要求較高、實驗條件苛刻；而且，異位及原位移植瘤模型的腫瘤皆不是由胰腺自身產(chǎn)生的，不能真正模擬人胰腺癌的發(fā)病機制及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程；基因工程胰腺癌動物模型胰腺病變在遺傳學(xué)及生物學(xué)方面可能與人類明顯不同，花費較高，數(shù)量上難以滿足實驗要求。

20世紀(jì)70年代，Pour等[12]最早應(yīng)用BOP誘導(dǎo)金黃地鼠胰腺癌。方法是按10 mg/kg體質(zhì)量給金黃地鼠皮下注射BOP，每周1次，持續(xù)終身后將注射次數(shù)改進(jìn)為10次，最早于第1次注射后第10周發(fā)現(xiàn)胰腺瘤變，于第13周開始出現(xiàn)較高的胰腺腺瘤及胰腺腺癌發(fā)生率。基于不同動物的BOP誘導(dǎo)實驗表明，金黃地鼠經(jīng)BOP誘導(dǎo)產(chǎn)生胰腺癌，而小鼠、大鼠則不產(chǎn)生胰腺癌，其原因尚不清楚。所有這些特點，使金黃地鼠成為胰腺癌模型的最佳選擇，而BOP成為化學(xué)誘導(dǎo)物質(zhì)首選[12]。

我們將BOP注射次數(shù)減為7次，減少了藥物的毒副作用，以減少動物的死亡率，同樣取得了相似的造模效果。實驗鼠出現(xiàn)了胰腺ATH、CIS、CA，代表了胰腺癌形成的不同階段。病理發(fā)現(xiàn)包括CIS、CA 共31個腫瘤，均為胰腺導(dǎo)管腺癌，起源于胰島內(nèi)及島周導(dǎo)管(小管)上皮細(xì)胞； ATH最早于第1次注射BOP后11周即有發(fā)現(xiàn)，19周以后所有的實驗組動物均發(fā)生ATH，而ATH被認(rèn)為是胰腺癌癌前病變。我們將ATH、CIS、CA合并統(tǒng)計，總成瘤率高達(dá)81.3%。在建模過程中，部分實驗鼠還出現(xiàn)了黃疸，表現(xiàn)為不同程度的鞏膜、唇周、四肢皮毛裸露部皮膚黃染，以及體重減輕、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(另文介紹)等人胰腺癌具有的表現(xiàn)。

該模型的意義在于建立的方法簡單，可重復(fù)性強，誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰腺腫瘤組織病理學(xué)及臨床表現(xiàn)與人胰腺癌相似，可用于研究胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制及其細(xì)胞、病理、分子生物學(xué)特性；還可評估藥物療效以及藥物、飲食等對胰腺癌肝轉(zhuǎn)移、肝脂質(zhì)過氧化的影響等[12-16]。該實驗提供了一種理想的胰腺癌體內(nèi)研究動物模型。

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