VEGF-D在口腔鱗癌相關成纖維細胞的表達研究

劉 英，莫金龍，劉 震，唐婉容

(1.川北醫學院附屬醫院口腔科，四川 南充 637000；2.遂寧市中心醫院信息科，四川 遂寧 629000 )

鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔腫瘤中最常見的惡性腫瘤，約占90%以上，頸淋巴結轉移是口腔癌早期常見的轉移途徑，其轉移率高達37%～58%，是導致早期口腔鱗癌治療失敗的重要原因[1]。近年來，腫瘤微環境日益成為研究熱點，學者們發現間質細胞與癌上皮細胞的交互作用在腫瘤的發生發展中起著重要作用[2]。在實體腫瘤微環境中，成纖維細胞是數目眾多、功能強大、獲得活化表型的間質細胞，被稱為癌相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs) 。CAFs通過其產生的多種生長因子以及趨化因子影響腫瘤細胞的生長和轉移[3-4]。已有研究表明CAFs分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在促進口腔癌血管生成及遠處轉移中起作用，本研究旨在探究CAFs是否促進淋巴管的生成，在口腔癌的淋巴結轉移中是否起作用。

1 材料和方法

1.1 用于原代人口腔鱗癌CAFs培養的標本收集

收集川北醫學院附屬醫院口腔頜面外科原發性OSCC患者組織，所有患者術前均未行化療、放療和其他生物治療，所有標本均由病理科確診。所取組織包括癌鄰近結締組織用于CAFs分離培養，手術邊界正常結締組織用于NFs分離培養。手術標本切取過程中嚴格無菌操作，取材后立即放入含有雙抗的磷酸鹽緩沖液中，在超凈臺內修剪完成后續操作(標本信息見表1 )。

表1 用于原代CAFs培養的標本信息

1.2 人口腔CAFs和NFs的分離培養及鑒定

運用CAFs組織塊分離培養方法，在超凈臺內修剪組織，取鄰近癌上皮的結締組織和手術邊界正常的結締組織分別用于CAFs和NFs的分離培養。用眼科剪將組織剪成1 mm3左右的小塊，用含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的PBS液漂洗3次，用眼科鑷送入培養瓶，用牙科探針將組織塊在瓶底上均勻擺置。加入含10%胎牛血清的DMEM培養基(HyClone公司產)，培養條件為37 ℃，5%CO2飽和濕度，3～5 d換液。0.25%胰酶消化傳代，差速消化法對CAFs進行純化，得到第3代純化細胞，實驗用6代以內的細胞[3，6]。

1.3 細胞組化鑒定口腔CAFs

胰酶消化細胞后，均勻接種至細胞爬片上，加培養基2 mL，培養2～3 d，觀察細胞鋪滿爬片40%～60%，用4%多聚甲醛固定后用于細胞組化染色檢測。固定細胞用0.5% TxitonX-100處理后，在相同條件下采用SP法試劑盒進行免疫組化染色，以PBS作為陰性對照，每例樣本組每個指標設3個平行細胞爬片染色。采用鼠抗人cytokeratin、vimentin、α-SMA、VEGF-D抗體檢測，其中cytokeratin、vimentin、α-SMA購自北京中杉金橋試劑公司，一抗稀釋度分別為1∶200、1∶200、1∶100；VEGF-D購自Abcam，一抗稀釋度為1∶200。同時結合觀察細胞的形態和生長方式，對生長至第3代的細胞進行初步鑒定。

1.4 RT-PCR檢測CAFs表達VEGF-D的mRNA水平

取對數生長期的細胞，分別提取CAFs和NFs的RNA，參照試劑盒說明(TakaRa)每例樣本組設 3 個平行復孔，實驗重復3次。VEGF-D引物為上游5’-AGC TGG GGA AGA GTA CCA ACA-3’，下游為5’-CAC AGA GAG CTG GTT CCT GGA-3’，以β-actin基因作為內參。采用RT-PCR 儀自帶分析軟件分析各樣品mRNA表達情況，相對定量采用 2-ΔΔCT法計算。通過計算CT值的方法對VEGF-D mRNA進行相對定量分析。

1.5 統計學分析

實驗結果用SPSS17.0軟件統計分析，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 人口腔CAFs的分離培養及鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察，CAFs生長速度較快，細胞排列無序，密度和接觸抑制喪失，細胞體和細胞核均較大。正常成纖維細胞NFs排列規則，無重疊生長，密度和接觸抑制保留，胞體和胞核較小。通過細胞組化染色，原代培養的CAFs和NFs 細胞均表達Vimentin，而不表達Cytokeratin，這證明無論是CAFs還是NFs均為成纖維細胞來源，而非上皮細胞來源。CAFs表達α-SMA，染色陽性，證明是生物學特性已經發生變化的癌旁成纖維細胞，見圖1、圖2。

2.2 細胞免疫組化染色顯示人口腔CAFs、NFs表達VEGF-D 的差異

細胞爬片組化染色的陽性抗原定位準確，背景著色淺或無，顏色鮮明，二者的比值大于1(陽性/背景)，(HRP-DAB/H2O2)則表現為淡黃色細顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，染色強度分“弱(+)、中(++)、強(+++)”3級。細胞免疫熒光法(FITC為例)則表現為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠眼熒光；后者耀眼易見。

VEGF-D免疫染色陽性物質主要存在于胞漿，陽性染色表現為淺淡黃色細顆粒，熒光染色陽性表現為綠色熒光。NFs、無淋巴結轉移CAFs、淋巴結轉移CAFs均表達VEGF-D陽性，但CAFs表達高于NFs，而淋巴結轉移CAFs又明顯高于無淋巴結轉移CAFs。實驗重復3次，染色強度趨勢一致(圖3代表1次染色結果)。

2.3 用RT-PCR檢測VEGF-D mRNA在CAFs、NFs 的表達

采用Quantitative Real-time PCR檢測VEGF-D mRNA 在 CAFs和NFs的表達，采用 2-ΔΔCT法以β-actin為內參基因，計算其表達值。用SPSS17.0軟件統計分析，組間比較采用單因素方差分析。可見VEGF-D的mRNA在淋巴結轉移CAFs明顯升高(P<0.05)，見表2與圖4。

表2 NFs、CAFs表達VEGF-D mRNA均值

*P<0.05，與NFs組比較；#P<0.05，與無淋巴結轉移CAFs組比較。

3 討論

口腔癌發病率較高，位居全身惡性腫瘤的第6位。鱗狀細胞癌是口腔腫瘤中最常見的惡性腫瘤，約占90%以上，治療后5年生存率仍然徘徊在50%左右。頸淋巴結轉移是口腔癌早期常見的轉移途徑，其轉移率高達37%～58%，只要有同側或對側單個淋巴結轉移，其生存率會降低50%左右，這是導致早期OSCC治療失敗的重要原因[5]。所以，OSCC的淋巴結轉移對于其預后評估和治療方法的選擇具有重要意義。腫瘤的發生、發展與微環境密切相關，腫瘤細胞與間質的相互作用，既保證其生存又促進其向惡性發展和轉移。在實體腫瘤的微環境中，成纖維細胞是最豐富的一類細胞，已有大量研究表明，腫瘤微環境中的CAFs與正常成纖維細胞不同，已經發生表型及功能的改變，在介導OSCC的發生、調節發展、促進血管生成及調控免疫信號等方面起核心作用[6-9]。但對于CAFs在口腔鱗癌淋巴管生成的作用卻少有研究。因此，本課題旨在探究CAFs是否促進淋巴管的生成，在OSCC的淋巴結轉移中是否起作用。

淋巴管在腫瘤的生長、轉移中起著重要作用。首先，在腫瘤生長早期，其營養物質主要靠彌散方式及微淋巴管提供；其次，腫瘤淋巴管是腫瘤細胞轉移的重要途徑 。VEGF是調節血管生成的最重要因子之一，在腫瘤新生血管生成中起著重要的作用。VEGF-C/D是淋巴管生成因子，能誘導腫瘤淋巴管的生成，進而促進淋巴結轉移。已有研究表明VEGF-C在乳腺癌、前列腺癌、肺癌組織中增高表達，并對促進淋巴管轉移有作用[10-12]。VEGF-D基因定位于性染色體Xp22.31上，全場50 kb，1998年由Achen等確認為VEGF家族中的新成員。Karnezis等[13]在對乳腺癌的研究中發現，VEGF-D能促進前列腺素的分泌，擴張淋巴管，從而促進腫瘤細胞經淋巴管的轉移(Cancer Cell，2012)。對于口腔CAFs是否分泌VEGF-D，是否促進OSCC的淋巴結轉移目前未見有相關研究。

在本研究中，我們首先用組織塊培養法獲得口腔CAFs，用差速胰酶消化法純化細胞，3～4代CAFs能很好的純化而沒有癌上皮細胞的污染。用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態及生長情況，用cytokeratin、vimentin、α-SMA進行表達蛋白的鑒定，發現CAFs與NFs相比，生長增殖速度快，密度抑制和接觸抑制喪失，細胞排列無序；Vimentin、α-SMA 染色均為陽性，Cytokertain染色為陰性，具有CAFs的基本生物學特性。對所獲得的CAFs和NFs細胞進行VEGF-D的細胞免疫組化和免疫熒光的對比研究，證明了CAFs和NFs均表達VEGF-D，但CAFs表達高于NFs，且有淋巴結轉移的CAFs高于無淋巴結轉移的CAFs。通過RT-PCR檢測VEGF-D mRNA的表達量，用2-ΔΔCT法計算與內參基因β-actin的比值，分別為0.806 7±0.117、1.192 5±0.125、2.085 3±0.131。結果顯示，VEGF-D mRNA表達水平在淋巴結轉移的CAFs明顯升高。以上實驗初步證明了口腔CAFs分泌VEGF-D較NFs有所升高，其表達水平升高可促進口腔鱗癌的淋巴結轉移。

口腔CAFs能夠影響腫瘤微環境中的腫瘤細胞、內皮細胞、炎性細胞等，促進腫瘤細胞的生長增殖，通過增加分泌VEGF、VEGF-D促進OSCC的血管和淋巴管轉移，顯示其在口腔癌發生發展中的重要作用[14-15]。CAFs靶向腫瘤治療旨在對其進行特異性生物學干擾，同時抑制其在腫瘤發生發展各方面的介導作用。這既可以干擾腫瘤進展轉移的能力，又可以克服針對癌細胞治療的耐藥性。本研究僅對CAFs表達VEGF-D進行了研究，對其調控機制及信號傳導均有待深入研究。

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