異育銀鯽消化道微生物群落對(duì)恢復(fù)投喂的響應(yīng)

李星浩顏慶云胡紅娟李金金王 純余育和

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

異育銀鯽消化道微生物群落對(duì)恢復(fù)投喂的響應(yīng)

李星浩1,2顏慶云1胡紅娟1,2李金金1,2王 純1,2余育和1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

以實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)“中科3號(hào)”成魚為對(duì)象, 利用PCR-DGGE技術(shù)比較研究了其經(jīng)饑餓與恢復(fù)投喂后消化道微生物多樣性的變化。實(shí)驗(yàn)共檢測到23條譜帶, 其中饑餓組、投喂組譜帶數(shù)分別為18條和17條(共有譜帶12條), 投喂組大部分譜帶亮度高于饑餓組?；赑CR-DGGE所得到的譜帶進(jìn)行的 CA (Correspondence Analysis)分析和聚類都表明饑餓組與投喂組消化道微生物存在明顯不同。結(jié)果表明, 在充分饑餓處理后, 恢復(fù)飼料投喂可導(dǎo)致消化道微生物種類減少及微生物平均密度的增加,同時(shí)對(duì)消化道微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)微生物種類組成有顯著影響。研究為進(jìn)一步闡述消化道微生物功能基因奠定了基礎(chǔ), 也為水產(chǎn)魚類腸道菌群研究提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

異育銀鯽; 消化道微生物群落; PCR-DGGE; 腸道微生態(tài)系統(tǒng)

腸道對(duì)于動(dòng)物來說就像是內(nèi)在生命線, 而腸道內(nèi)微生物影響著腸道眾多功能的發(fā)揮, 因此關(guān)于腸道內(nèi)微生物的研究近幾年也越來越被重視[1]。已有研究表明, 魚類消化道微生物對(duì)魚的免疫、營養(yǎng)等都有重要影響[2,3], 消化道內(nèi)微生物群落的平衡穩(wěn)定可以促進(jìn)魚體健康的生長。魚類消化道微生物在影響著宿主魚的同時(shí), 其組成也受著宿主自身與外界因素的影響[4—6], Romero等發(fā)現(xiàn)銀大麻哈魚(Oncorhynchus keta)消化道微生物群落在第一投喂階段后才穩(wěn)定[7], 而李學(xué)梅等對(duì)室內(nèi)養(yǎng)殖的斑點(diǎn)叉尾、銀鯽和異育銀鯽的消化道微生物進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)不同種魚的消化道微生物的種類組成有顯著差異[8], 同時(shí)尹軍霞等研究發(fā)現(xiàn)同種魚消化道不同區(qū)段的微生物組成也存在很大不同[9], 另外, Margolis早在 1952年用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)經(jīng)過饑餓處理的大頭魚(Ameiurus nebulosus)及斑點(diǎn)鱒(Salaeliruts fontinali)的消化道細(xì)菌進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)饑餓使消化道微生物種類減少[10]。以上研究表明消化道微生物與宿主魚之間存在密切關(guān)系。對(duì)于外界條件變化,消化道微生物自身是否存在響應(yīng)機(jī)制呢？本研究選用消化道微生物群落已相對(duì)穩(wěn)定的異育銀鯽“中科3號(hào)”[11]成魚作為研究對(duì)象, 并將其消化道作為相對(duì)封閉的微型生態(tài)系統(tǒng)來研究[12], 旨在進(jìn)一步闡述飼料這一魚類營養(yǎng)源在作為消化道微生態(tài)系統(tǒng)外界干擾時(shí)對(duì)其內(nèi)部物種組成的影響, 為今后研究消化道微生物功能基因指明了方向, 同時(shí)為水產(chǎn)魚類腸道菌群研究提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與樣品采集

實(shí)驗(yàn)魚飼養(yǎng)于中國科學(xué)院水生生物研究所魚類生理生態(tài)學(xué)學(xué)科組循環(huán)水系統(tǒng)中, 水溫為 24—28℃,期間投喂人工配合飼料, 待性成熟后進(jìn)行饑餓處理30d, 隨機(jī)抽取3尾同規(guī)格的魚, 在編號(hào)A、B和C后解剖取樣, 取樣時(shí)用 75%的酒精擦拭腸外壁, 分前腸、中腸和后腸取樣, 取得 9份樣品分別編號(hào)H1-H9 (H1、H2、H3代表A的前腸、中腸和后腸, H4-H6及H7-H9對(duì)應(yīng)代表B和C的前腸、中腸和后腸), 保存用于微生物 DNA的提取; 再給剩下的魚投喂相同人工配合飼料, 25d后再次隨機(jī)抽取3尾同規(guī)格的魚編號(hào)D、E和F, 解剖取樣得9份樣品, 分別編號(hào) F1-F9(F1、F2、F3代表D的前腸、中腸和后腸, F4-F6及F7-F9對(duì)應(yīng)代表E和F的前腸、中腸和后腸), 保存用于微生物DNA的提取。

1.2 消化道微生物總DNA的提取

實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取腸道微生物總DNA[8,13], 即: 向每管樣品中加入 1.2 mL裂解液(0.5% SDS; 10 mmol/L Tris-Cl, pH8.0; 10 mmol/L EDTA, pH8.0; 100 mmol/L NaCl; 蛋白酶K 100 μg/mL; RNase A, 50 μg/mL), 37℃水浴 1h后, 加入 PK (20 mg/mL) 6 μL, 55℃過夜(12h, 至清亮); 取上清液進(jìn)行DNA抽提, DNA在4℃下經(jīng)24h沉淀后, 離心干燥并加入100 mL無菌水溶解, –20℃保存?zhèn)溆?總DNA 用0.7%的瓊脂糖凝膠(含EB)進(jìn)行電泳以檢測提取效果[14,15]。

1.3 PCR-DGGE分析

采用細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)通用引物(F357-GC和R518)對(duì)所得18個(gè)樣品中的腸道細(xì)菌DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 將擴(kuò)增得產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析[16,17],變性劑濃度范圍為40%—70%, 凝膠在110V下經(jīng)過12h的電泳后紫外照相, 由于投喂組F5和F6未能得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 樣品F5和F6不參與數(shù)據(jù)分析, 使用Quantity One (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)軟件對(duì)譜帶進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在得到各泳道及譜帶亮度等詳細(xì)信息并轉(zhuǎn)化為0/1矩陣后, 使用Canoco 4.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行CA (Correspondence Analysis)分析, 通過R 3.0.0對(duì)各泳道數(shù)據(jù)進(jìn)行基于 Jaccard指數(shù)的相似性分析并繪制聚類圖[18], 通過Microsoft Excel 2010對(duì)譜帶數(shù)量及亮度值進(jìn)行分析并繪圖, 同時(shí)計(jì)算譜帶亮度值的方差值以比較兩組中各物種分布密度的變異程度大小。

2 結(jié)果

2.1 消化道微生物群落PCR-DGGE指紋分析

針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行的PCR-DGGE指紋分析共檢測到 23條不同的譜帶(圖 1), 其中饑餓組譜帶數(shù)為18條, 投喂組譜帶數(shù)為17條, 兩組共有譜帶12條, 由圖上可以看出饑餓組特異性譜帶穩(wěn)定且與投喂組存在明顯差別, 以實(shí)驗(yàn)魚為操作單元,基于全腸微生物種類分布的相似性聚類分析表明(圖2), 饑餓組A、B和C聚為一枝, D、F聚為一枝。

圖1 16S rDNA變性梯度凝膠(DGGE)電泳圖Fig. 1 DGGE patterns of 16S rDNA

圖2 16S rDNA圖譜相似性比較Fig. 2 Comparison of similarity based on DGGE fingerprints of 16S rDNA

2.2 消化道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性

CA結(jié)果顯示除樣品F9外, 投喂組(F1- F4, F7, F8)與饑餓處理組(H1- H9)消化道存在明顯差異, 投喂組樣品主要存在于第二、三象限, 饑餓組主要存在于第一象限, 且投喂組各樣品總體聚集較饑餓組更緊密(圖3), 表明投喂組各樣品間消化道微生物群落種類組成相似性高于饑餓組; 為了更直觀的顯示各消化道微生物群落的差別, 基于 Jaccard指數(shù)相似性聚類結(jié)果顯示除F1、F2樣品外, 饑餓組和投喂組大部分分別聚為兩大枝(圖4)。

圖3 基因16S rDNA指紋圖譜的CA分析Fig. 3 Correspondence analysis based on PCR-DGGE fingerprints of 16S rDNA

2.3 消化道微生物群落結(jié)構(gòu)比較

對(duì)兩組樣品中的各個(gè)譜帶進(jìn)行比較顯示, 饑餓組擁有譜帶數(shù)為18, 投喂組擁有譜帶數(shù)為17, 兩對(duì)照組共同擁有譜帶B3、B4、B8、B9、B10、B12、B13、B15、B18、B19、B20和B22, 共計(jì)12條(圖5); 其中B3、B13、B15和B20在饑餓組和投喂組中出現(xiàn)頻率較高, 分別為77.8%與100%、100%與71.4%、77.8%與57.1%、77.8%與71.4%, 屬高頻率共有譜帶; 結(jié)果還顯示, 饑餓組中不存在的譜帶為B11、B14、B16、B17和B21, 投喂組中不存在的條帶為B1、B2、B5、B6、B7和B23, 兩者存在明顯差異。

為更清晰的了解兩組中各譜帶的存在以及分布情況, 我們計(jì)算并比較了兩對(duì)照組中各條帶的平均亮度, 結(jié)果顯示(圖 6), 投喂組 56.5%的譜帶平均亮度大于饑餓組, 且投喂組中最大亮度與最小亮度之差(2901.99)遠(yuǎn)大于饑餓組最大亮度與最小亮度之差(1508.55); 對(duì)兩組方差值進(jìn)行計(jì)算, 結(jié)果顯示, 饑餓組方差值(365.79)小于投喂組方差值(885.67), 表明饑餓組各樣品間各微生物分布密度的變異程度小于投喂組。

圖4 基于16S rDNA指紋圖譜的聚類分析Fig. 4 Clustering on the basis of 16S rDNA bands

3 討論

魚類消化道作為一個(gè)微型生態(tài)系統(tǒng), 其內(nèi)部生活的微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)有適應(yīng)性反應(yīng)[19], 同時(shí)魚類腸道的生物性結(jié)構(gòu)差異為生活于其內(nèi)的微生物造就了不同的生境, 這對(duì)其內(nèi)微生物分布以及擴(kuò)散有很大的影響[5,20]。對(duì)同一種魚來說, 成魚的消化道較幼魚的消化道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定, 受到水中微生物以及溫度等的影響較幼魚的小[21]。因此, 本研究選用成魚消化道作為研究腸道微型生態(tài)系統(tǒng)的對(duì)象, 以飼料作為這一微型生態(tài)系統(tǒng)的“干擾”具有很高的可行性。

圖5 各譜帶在兩對(duì)照組中出現(xiàn)的頻率比較Fig. 5 Comparison based on the frequency of bands in 2 groups

圖6 兩對(duì)照組中各譜帶亮度值的比較Fig. 6 Comparison on the intensity of bands between 2 groups

異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)自1985 年由中國科學(xué)院水生生物研究所育成以來, 迅速被眾多養(yǎng)殖戶以及大眾接受[22], 而“中科3號(hào) ”品系目前已成為為我國大宗水產(chǎn)養(yǎng)殖品種, 對(duì)該魚的研究具有很好的實(shí)際意義。基于前人的探索, 本研究選用了異育銀鯽成魚作為研究對(duì)象, 用飼料作為干擾因素以探索消化道這一微型生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落對(duì)恢復(fù)飼料投喂的響應(yīng)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)充分饑餓后恢復(fù)投喂導(dǎo)致腸道微生物發(fā)生明顯變化, 首先是腸道微生物種類數(shù)量下降, 并且 CA分析顯示投喂組樣品間微生物群落物種組成相似性高于饑餓組, 然而Manuel等認(rèn)為, 在宏觀生態(tài)系統(tǒng)中, 更多的能量來源可以支持更多的生物種群的存活[23], 推測本研究這一結(jié)果可能與Bitry[24]研究有關(guān), 飼料等營養(yǎng)物質(zhì)可在一定程度上影響前、中和后腸的差異[25—26], 盡管恢復(fù)飼料投喂增加了消化道微型生態(tài)系統(tǒng)的能量來源, 但相比于空腸, 恢復(fù)投喂后, 同質(zhì)的飼料充滿了投喂組實(shí)驗(yàn)魚的腸道, 在降低了實(shí)驗(yàn)魚前腸、中腸、后腸的“生境”差異并導(dǎo)致微生物種類的下降, 同時(shí)還使得使得各腸道樣品之間的總差異減少。

在分析比較了兩組條帶的豐度和亮度后, 發(fā)現(xiàn)投喂組樣品平均亮度高于饑餓組樣品平均亮度, 表明饑餓后恢復(fù)投喂使得腸道微生物總體分布密度上升。投喂組中最大亮度(B20)與最小亮度(B18)之差(2901.99)遠(yuǎn)大于饑餓組最大亮度(B13)與最小亮度(B4)之差(1508.55), 且對(duì)比饑餓組方差值(365.79)與投喂組方差值(885.67)表明投喂組腸道樣品中微生物的種間密度差異遠(yuǎn)大于饑餓組, 推測該結(jié)果與Kamada等研究有關(guān)。Kamada等用小鼠研究表明消化道微生物物種間存在生存競爭關(guān)系[27]; 本實(shí)驗(yàn)飼料的恢復(fù)投喂在增加了能量來源并使得微生物數(shù)量增加的同時(shí), 還使得微生物種間競爭加劇, 加速形成“優(yōu)勢(shì)種”并導(dǎo)致各微生物密度向兩極分化, 微生物物種間競爭強(qiáng)度的增加使得有限的生境內(nèi)能容納的微生物種類數(shù)量減少, 這一結(jié)果在宏觀生態(tài)系統(tǒng)研究中也得到證實(shí)[28,29]。伴隨著B20密度在投喂后急劇增加以及B1、B2、B5、B6、B7和B23這五個(gè)低亮度條帶的消失, 新出現(xiàn)了B11、B14、B16、B17和B21這五個(gè)條帶平均亮度較高的譜帶, 其代表的是腸道內(nèi)物種的更替, 推測其與飼料中攜帶的微生物有關(guān)[30,31]。

以上研究結(jié)果表明, 充分饑餓后恢復(fù)投喂會(huì)導(dǎo)致腸道微生物發(fā)生明顯變化, 本實(shí)驗(yàn)以恢復(fù)投喂飼料作為這一微型生態(tài)系統(tǒng)的“外界干擾”, 在其帶入新的微生物同時(shí), 使得微生物密度增加并導(dǎo)致種間競爭加劇, 說明在魚類消化道中存在一個(gè)完整的微型生態(tài)系統(tǒng)。本研究為下一步研究這一現(xiàn)象作用機(jī)制是否與微生物或魚腸道本身的功能基因有關(guān)指明了方向, 也為研究魚類腸道內(nèi)具有特定功能的菌群奠定了基礎(chǔ)。

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EFFECTS OF REFEEDING ON THE DIVERSITY OF INTESTINAL MICROFLORA IN ALLOGYNOGENETIC CRUCIAL CARP (CARASSIUS AURATUS GIBELIO)

LI Xing-Hao1,2, YAN Qing-Yun1, HU Hong-Juan1,2, LI Jin-Jin1,2, WANG Chun1,2and YU Yu-He1
(1. Key Laboratory of Biodiversity and Conservation of Aquatic Organisms, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

In this study, we applied PCR-DGGE fingerprinting to investigate the effects of refeeding on the diversity of intestinal microflora in allogynogenetic crucian carp. Fishes were reared in a semi-recirculating system until maturation at Institute of Hydrobiology. After the 30-day starvation, fishes were divided into two groups (the hungry group and the feed group). Three fishes were blindly selected from the hungry group for the extraction of the microbial DNA with the traditional Phenol-chloroform method. In the meanwhile, fishes in the feed group resumed to be fed. Three fishes in the feed group were blindly selected for extraction of the microbial DNA after 25 days. The PCR-generated bacterial DNA products were separated using a polyacrylamide gel as it exhibited increasingly higher concentrations of chemical denaturant. Correspondence Analysis (CA) and clustering based on Jaccard index was used to analyze the similarity of the samples. The results showed that the feed group displayed less bands than the hungry group. There was significant difference in the deleted bands between the feed group (B1, B2, B5, B6, B7 and B23) and the hungry group (B11, B14, B16, B17 and B21), so we reasoned that the similarity of microflora between the two groups was low. The variance analysis showed that the variance within the feed group was larger than that within the hungry group. In conclusion, our results suggested that refeeding had strong effects on the diversity of intestinal microflora in allogynogenetic crucian carp.

Carassius auratus gibelio; Intestinal Microflora; PCR-DGGE Fingerprinting; Intestinal Micro-Ecosystem

S965.1

A

1000-3207(2014)05-0854-06

10.7541/2014.128

2013-07-22;

2014-02-12

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2009CB118705); 國家自然科學(xué)基金(31172084)資助

李星浩(1990—), 男, 江西新建人; 碩士研究生; 主要從事淡水魚類消化道微生物研究。E-mail: lixhao90@163.com

余育和(1956—), 男, 湖南汨羅人; 研究員; 主要從事原生動(dòng)物學(xué)及魚類消化道微生物研究。E-mail: yhyu@ihb.ac.cn