農桿菌介導韭菜遺傳轉化相關因素的研究

農桿菌介導韭菜遺傳轉化相關因素的研究

常婧1高行英1李小東2侯雷平1李梅蘭1
（1.山西農業大學園藝學院，太谷 030801；2.方興現代農業有限公司，長治 046600）

以“漢中冬韭”韭菜品種為試驗材料，用含有pCAMBIA3301質粒的根癌農桿菌菌株EHA105對影響韭菜遺傳轉化效率的多種因素進行研究。結果表明，誘導40 d的愈傷組織，GUS基因瞬時表達率達到93%，且最適宜于不定芽的分化；當乙酰丁香酮（AS）的濃度為100 μmol/L時，愈傷的GUS表達率達到91%，植株再生率為7.9%，AS濃度增加時其值也不會增加；菌液OD600值為0.6侵染10 min時，與其他組合相比，外植體受傷程度小，GUS表達率及再生率最高；侵染后的愈傷共培養3 d后，農桿菌生長較少，GUS表達率為91.1%，而再生率達到7.2%，為最佳的共培養時間。通過試驗得到韭菜遺傳轉化因素的最佳條件，為今后的遺傳轉化提供一些參考。

韭菜 農桿菌 GUS染色 遺傳轉化

韭菜（Allium tuberosumRottl. Ex Spreng）別名草鐘乳、起陽草，是百合科蔥屬多年生宿根草本植物，具有一種特殊而且強烈的韭香氣味，主要以葉片、假莖供食，為我國特有的一種蔬菜［1］。韭菜不僅營養豐富，而且具有多方面的保健功能［2］。另外，韭菜的自然群體內缺乏有效的抗病、蟲、草等基因，因此應用轉基因技術進行韭菜新品種的開發是相當必要的。

目前國內外關于韭菜遺傳轉化的研究較少。僅張松等［3］以GUS報告基因建立了農桿菌介導韭菜轉化體系，尚沒有轉基因品種成功的報道。但蔥蒜類其他作物的遺傳轉化已經比較成熟，尤其是洋蔥和大蒜［4］。迄今為止，已經成功獲得了抗除草劑［5］、抗蟲［6］和抗逆性［7］等多個品種，盡管轉化的方法法有基因槍法和農桿菌介導法，但大多數采用的是農桿菌介導的方法。由于農桿菌介導法具有簡便、

單拷貝等優點，已經廣泛應用于植物的遺傳轉化中，但是該方法的建立需要高效的再生系統作為前提。因此，本試驗就影響農桿菌介導韭菜遺傳轉化效率的主要因素包括愈傷組織大小、乙酰丁香酮（AS）濃度、菌液濃度和侵染時間及共培養時間等進行研究，得到韭菜遺傳轉化的最佳因素，為今后的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗采用韭菜品種“漢中冬韭”，種子購于山西省侯馬市農人種業有限公司。供試根癌農桿菌菌株為EHA105，內含pCAMBIA3301載體，該載體攜帶有選擇標記Bar 基因和GUS報告基因。

1.1.2 培養基 本試驗過程中所用的培養基，見表1。

表1 韭菜遺傳轉化培養基

各種培養基配好后，在121℃高溫高壓滅菌20 min，其中AS、頭孢霉素（Cef）和草丁膦（PPT）在培養基滅菌后降溫到55℃時再加入。

1.2 方法

1.2.1 韭菜愈傷組織誘導 將韭菜種子沖洗干凈，

在75% 乙醇中消毒30 s，無菌水沖洗3-5次，再用含0.1 % 升汞和0.1 % Tween-20的混合溶液消毒10 min，無菌水沖洗3-5次，消毒后的種子放置在播種培養基中，黑暗環境生長2 d后，轉移到光照條件下培養。7 d左右，種子萌發生長獲得1 cm左右無菌胚根，切取胚根尖1.5-2 mm放置誘愈培養基中誘導愈傷組織用于轉化。

1.2.2 農桿菌培養與活化 取30 μL EHA105原菌接種到30 mL LB（含50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平）液體培養基中，在28℃ 200 r/min震蕩培養。16 h后，菌株處于對數生長期，此時活性最高，OD600值在1.2-1.5之間，5 000 r/min離心5 min。倒掉上清液，重新懸浮于誘導培養基中，于200 r/min震蕩培養活化4 h即可用于轉化。

1.2.3 愈傷組織大小對轉化的影響 將分別培養10、20、30、40、60 d的愈傷組織（圖1-A）切成2 mm大小，在活化的菌液（OD600=0.6）中侵染10 min，用濾紙吸干多余的菌液，放置在共培養基中25℃黑暗培養3 d。之后將愈傷組織轉移到選擇培養基中，選擇培養7 d后，隨機抽取20個愈傷外植體進行GUS染色，檢測GUS基因的瞬時表達率。之后，2周轉接一次，培養30 d左右后，統計韭菜愈傷組織的再生率（圖1-B）。

圖1 愈傷組織及不定芽的分化

1.2.4 乙酰丁香酮濃度對轉化的影響 在誘導培養基和共培養中分別加入0、100、200 μmol/L的AS用于侵染和共培養，共9個試驗組合。將愈傷組織在含不同濃度AS的誘導培養基中侵染10 min，之后步驟及統計觀察同1.2.3。

1.2.5 農桿菌菌液濃度對轉化的影響 將搖好的菌液重懸于誘導培養基中活化后，將菌液OD600值分別調節到0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，分別與40 d大小的愈傷組織（切成2 mm大小）侵染10 min，之后步驟及統計觀察同1.2.3。

1.2.6 農桿菌侵染時間對轉化的影響 將40 d大小的愈傷組織切成2 mm的小塊，與OD600為0.6菌液分別侵染0、5、10、15、20 min，之后步驟及統計觀察同1.2.3。

1.2.7 共培養時間對轉化的影響 將40 d大小愈傷組織切成2 mm的小塊，與OD600為0.6菌液侵染10 min，分別共培養0、1、2、3、4、5 d，之后步驟及統計觀察同1.2.3。

1.2.8 愈傷組織的GUS染色 將愈傷組織浸沒于GUS染色液中，置于37℃恒溫箱中過夜，次日用70% 乙醇脫色，觀察GUS染色的效果。

2 結果

2.1 韭菜愈傷組織大小對遺傳轉化的影響

由韭菜胚根尖誘導不同時期愈傷組織的GUS染色效果（圖2）表明，愈傷培養10 d時，愈傷組織僅有很少面積呈現藍色；培養20 d時，愈傷的染色面積明顯增加；隨著培養時間的增加，愈傷經過切割后，菌液侵染切面GUS染色的面積會更大。統計結果表明（表2），愈傷培養10 d時，GUS瞬時表達僅有55%；隨著培養時間的增加，GUS瞬時表達顯著提高；培養40 d時，GUS瞬時表達率達到93%；培養時間進一步延長，GUS瞬時表達率不再增加。

觀察植株轉化后的再生，培養10 d的愈傷經侵染后褐化嚴重，逐漸死亡，僅有1.07%再生；培養20和30 d的愈傷侵染后，愈傷組織褐化減少，植株再生率分別達到3.13%和4.93%；當愈傷培養40 d時，再生率達到最大為7.21%。培養60 d時，愈傷組織的褐化率較低，但愈傷分化不定芽反而下降。綜上所述，在韭菜遺傳轉化過程中，采用培養40 d的愈傷組織為最佳。

圖2 不同愈傷組織大小GUS染色的效果

表2 愈傷組織大小對轉化的影響

2.2 乙酰丁香酮對韭菜遺傳轉化的影響

不同乙酰丁香酮濃度下韭菜愈傷的GUS染色（表3）表明，當誘導和共培養基中都不含AS時，愈傷染色面積小且顏色較淺，GUS染色率僅有32.5%；僅在誘導培養基中加入AS時，當AS為100 μmol/L時染色率為53.6%，當AS為200 μmol/L時，染色率提高為72.9%，但顏色依然較淺；僅在共培養基中加入AS時，當AS為100 μmol/L時染色率為66.2%，當AS為200 μmol/L時，染色效果提高顯著為84.4%，且隨著濃度的升高顏色變深；當誘導和共培養基中同時加入AS時，GUS染色率達到91%以上，愈傷組織的染色面積增大，且藍色很深。因此，從GUS染色的提高程度看，共培養基中添加AS對轉化的影響效果更高。

統計植株再生的結果（表3）表明，當誘導和共培養基中都不含AS時，大部分愈傷組織選擇培養1周后嚴重褐化，再生率僅有0.4%；當僅在誘導或共培養基中加入AS時，再生率都隨著AS的增加不斷地提高；當誘導和共培養基中AS濃度為100 μmol/L時，植株再生率達到7.9%；濃度進一步增加時，再生率達到8.0%左右與之前并沒有顯著增加。因此，在韭菜遺傳轉化中需要誘導和共培養基中同時加入100或200 μmol/L AS，考慮到成本，韭菜轉化中AS最佳濃度為100 μmol/L。

表3 乙酰丁香酮濃度對轉化的影響

2.3 菌液濃度對韭菜遺傳轉化的影響

不同菌液濃度侵染后韭菜愈傷GUS染色效果及百分率表明，當菌液OD600為0.1時，組織染色面積小，顏色比較淺（圖3），GUS基因的瞬時表達率為44.0%（表4）；隨著菌液濃度的增加，染色位點越多，顏色也越深，菌液OD600為0.6時，GUS瞬時表達率達到90%；當菌液OD600為0.8時，整個愈傷塊已完全染色，但是GUS基因的表達沒有顯著增加。

從韭菜愈傷再生方面，當OD600為0.1時，愈傷的再生率僅有1.4%；當OD600為0.6時，愈傷的分化達到7%，顯著的高于其他組合；濃度較低時，附著在愈傷表面的農桿菌較少，基因未整合到植株體內，在抗生素的作用下愈傷逐漸褐化死亡；菌液濃度過高時，附著在愈傷表面的菌液過多，不利除菌反而影響愈傷的再生效果。綜合各方面因素，OD600值為0.6是最適的菌液濃度。

表4 菌液濃度對韭菜轉化的影響

2.4 侵染時間對韭菜遺傳轉化的影響

不同侵染時間下愈傷的GUS染色效果（圖4）表明，未經過侵染的愈傷染色后呈現白色，外植體無傷害，GUS瞬時表達率與再生率均為0；侵染5 min的組織呈現淺藍色，GUS瞬時表達率為53.2%（表5），愈傷有較少切口變褐，再生率為3.26%；侵染10 min的愈傷呈現深藍色，GUS表達率達到90%以上，有部分傷口變褐，組織再生率最高，達到5.92%；侵染15 min以上的愈傷顏色繼續增大，GUS瞬時表達率并沒有顯著增加，愈傷褐化嚴重，再生率反而減低；總之，隨侵染時間的增長，GUS基因瞬時表達率越高，但愈傷受菌液傷害的程度也越嚴重，再生就越困難。綜合上述分析，愈傷組織在菌液中侵染10 min為最佳。外植體受傷程度輕，GUS基因瞬時表達率很高，再生率也最高。

2.5 共培養時間對韭菜遺傳轉化的影響

圖3 不同菌液濃度下（OD600值）韭菜愈傷GUS染色的效果

不同共培養條件下愈傷組織的GUS染色（圖5）

表明，共培養0 d時，GUS基因在愈傷組織即有表達，但染色效果較淺，GUS瞬時表達率為40.9%（表6）；共培養3 d后，愈傷呈現深藍色，GUS表達率接近最高值達到91.1%；共培養時間再長時，愈傷藍色更深，GUS表達不再顯著增加。另外，共培養2 d內，農桿菌生長不明顯，愈傷分化率低；共培養3 d時，農桿菌生長菌落依稀可見，但不超過外植體周圍，再生率達到7.2%；共培養4 d后，在外植體周圍出現少量菌落，而共培養5 d后，在外植體周圍出現大量菌落，植株再生率反而下降。綜合上述分析，共培養3 d后，農桿菌菌落少，GUS瞬時表達率也較高，再生率最高，為轉化時共培養的最佳時間。

圖4 不同侵染時間下韭菜愈傷GUS染色效果

表5 侵染時間對韭菜轉化的影響

圖5 不同共培養時間下韭菜愈傷GUS染色效果

表6 共培養時間對韭菜轉化的影響

3 討論

3.1 愈傷組織培養時間對轉化的影響

愈傷組織的大小是影響轉化的重要因子，前人的研究表明應用直接誘導的愈傷進行轉化效率較低，而愈傷組織經過多代培養后，可能產生體細胞突變且愈傷組織逐漸衰老死亡，不利于轉化體篩選，轉化效率反而大大降低，所以經過適當繼代培養，使細胞處于最佳轉化狀態來提高轉化效率［8］。鄭杰［9］在水稻的研究中發現表面光滑、質地致密、粒形好的愈傷組織轉化率最高。羅敬萍等［10］用不同齡期的甘蔗愈傷組織進行轉化，25 d的愈傷組織為適齡的轉化受體。楊愛國等［11］在玉米胚性愈傷的轉化中，采用不超過2.0 mm大小的幼胚誘導愈傷組織，經過10-12周不斷繼代擴繁得到干燥松散、有結構、生長旺盛的愈傷組織進行遺傳轉化。Aswath等［12］在洋蔥的遺傳轉化中，就采用6周大的愈傷分割成表面積為3 mm2的小塊進行轉化。本試驗研究表明韭菜胚根尖誘導愈傷組織培養40 d后，愈傷組織直徑達到5 mm，將其切為2 mm大小的轉化效果最佳。

3.2 乙酰丁香酮對轉化的影響

乙酰丁香酮是基因轉化中提高轉化頻率及基因

穩定遺傳和表達的重要試劑。在眾多研究中，AS的濃度一般為50-00 μmol/L，濃度過高反而會影響轉化效率或對外植體產生毒害作用［13］。Joubert等［14］研究了AS對洋蔥轉化的影響，當AS濃度為100 μmol/L時對轉化的促進效果最高；而對洋蔥幼胚進行轉化，AS濃度為250 μmol/L，組織GUS表達率為60%，濃度過高時表達率反而下降。邸宏等［15］對玉米幼胚的轉化體系進行優化，得到AS的適宜濃度為200 μmol/L。但是趙軍良等［16］在酚類物質對大白菜遺傳轉化的研究中表明，其中AS轉化的影響效果最佳且轉化率提高明顯，本試驗的研究也表明了這一點。本試驗在誘導和共培養基中同時加入100 或200 μmol/L時顯著性不差異，考慮AS的傷害作用和成本問題，AS的最佳濃度為100 μmol/L，與Joubert等的研究基本一致。

3.3 菌液濃度和侵染時間對轉化的影響

菌液濃度和侵染時間是影響遺傳轉化效率的重要因素。在蔥蒜類蔬菜的遺傳轉化中大多采用的菌液OD600為0.6左右，譚偉等［17］研究表明，當菌液OD600為0.6時，大蔥愈傷組織的轉化率均值最大。Eady等［15］在韭菜和大蒜轉化時，OD500下的菌液濃度為0.5-1.0時效果最佳。對于侵染時間，通常為5-20 min。劉海燕等［19］對洋蔥表皮進行轉化研究表明，菌液濃度OD600為0.6，侵染20 min時轉化率最高；孫傳波等［20］在玉米莖尖的轉化中表明，當菌液OD600為0.5時，浸泡7 min后抗性芽的生成率最高。同時，張明洲等［21］等在高粱轉化體系的優化中也表明，最佳的侵染時間和濃度為OD600為0.5侵染10 min，與本試驗結果相一致。

3.4 共培養時間對轉化影響

農桿菌共培養是農桿菌進入受體細胞并與其共生的過程，使細菌中的T-DNA轉入到受體細胞利于農桿菌侵染受體。附著在外植體表面的農桿菌并不能立刻轉化，而需要在組織停留一定時間。王沛雅等［22］的研究表明，當農桿菌與楊樹葉盤共培養4 d后，分化率可達80%并可獲得較多生長健壯的抗性再生芽。Kondo等［23］研究了共培養1-6 d對大蔥愈傷轉化的影響表明最佳時間為3 d。此外，王宏偉等［24］進一步研究了共培養時間與溫度間的關系，溫度為25℃時共培養3 d，GUS 表達率最高；而溫度為22℃時共培養5 d，GUS 表達率也較高。本試驗是在共培養溫度25℃前提下，得到的最佳的共培養時間為3 d，與王宏偉的研究結果一致，而對于共培養溫度和時間的關系有待進一步研究。

4 結論

韭菜愈傷組織培養時間40 d后，GUS基因瞬時表達率達到93%，且最適宜于不定芽的分化。侵染韭菜外植體的農桿菌重懸液和共培養基中添加AS能大大提高GUS表達率和再生率，同時AS濃度為100 μmol/L時，愈傷的GUS表達率達到91%，植株再生率為7.9%，AS濃度增加時其值也不會增加。當菌液OD600值為0.6侵染10 min后共培養3 d，外植體受傷程度小，農桿菌生長較少且容易抑制，GUS表達率及再生率最高，為最佳的轉化。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research on the Factors Related to Agrobacterium-mediated Genetic Transformation of the Chinese Chive

Chang Jing1Gao Xingying1Li Xiaodong2Hou Leiping1Li Meilan1
（1. College of Horticulture，Shanxi Agriculture University，Taigu 030801；2. Fangxing Modern Agriculture Co. Ltd, Changzhi 046600）

Using “Hanzhong Dongjiu” variety and the Agrobacterium EHA105 containing pCAMBIA3301 plasmid as the material, it studied the factors which could influence transformation efficiency of Chinese chive. The results showed that transient expression rate of GUS gene reached 93% with the callus cultured for 40 d as the explant and the adventitious buds differentiated well. When 100 μmol/L acetosyringone was added to the miedium, GUS expression rate of the callus reached 91% and the plant regeneration rate was 7.9%, but did not increase with increasing of the AS concentration. Compared with other combinations, the calli were soaked in Agrobacterium（OD600≈0.6）for 10 min, the injury degree of explants was slight and the GUS expression rate and regeneration rate were the highest. When the calli were co-cultured for 3 days after infection, the bacterium grew less than other period, GUS expression rate and the regeneration rate were 91.1% and 7.2% respectively. Through the experiment, the best conditions of genetic transformation factors for chinese chive were obtained.

Chinese chive Agrobacterium GUS staining Genetic transformation

2013-09-06

山西省農業科技攻關項目（20090311022，0110311015-1），山西省人事廳人才引進項目

常婧，女，碩士研究生，研究方向：蔬菜育種及生物技術；E-mail：412567956@qq.com

李梅蘭，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：蔬菜育種及生物技術；E-mail：limeilan_2@hotmail.com