水稻白葉枯病抗性基因Xa21的分子生物學研究進展

水稻白葉枯病抗性基因Xa21的分子生物學研究進展

陳小林 顏群 高利軍 高漢亮
（廣西作物病蟲害生物學重點實驗室 廣西農業科學院植物保護研究所，南寧 530007）

由黃單胞桿菌水稻致病變種Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）引起的白葉枯病是水稻重要細菌性病害之一。迄今，已有7個水稻白葉枯病抗性基因被克隆。Xa21是第一個被克隆的白葉枯病抗性基因，因具有廣譜抗性而受到廣泛的關注。對Xa21的發現、定位及克隆、表達特征、編碼產物XA21的生化特性、作用與調控以及XA21介導的免疫反應模式等方面的研究結果進行綜述，并對今后的研究方向進行展望。

水稻 白葉枯病 抗性基因 Xa21

由黃單胞桿菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo）引起的水稻白葉枯病是水稻最嚴重的細菌性病害之一［1，2］。受白葉枯病危害的田塊一般減產10%-20%，嚴重的減產50%以上，甚至絕收［3］。白葉枯病1909年首次在日本福岡地區出現，隨后在亞洲各國以及非洲、美洲和澳洲等地的水稻產區被發現，已成為一種世界性的水稻病害［4］。目前，我國除了新疆、西藏和東北北部以外，其余各稻區均有發生，尤其在南方稻區危害更為嚴重［3］。抗性基因的研究一直以來都是水稻白葉枯病防治的重要內容之一，并且已取得較大的成果。到目前為止，經注冊確認的和期刊報道的水稻白葉枯病抗性基因共38個，其中，Xa1、xa5、xa13，Xa21、Xa23、Xa26和Xa27等7個基因已成功被克隆［5-11］。Xa21是第一個被克隆出來的水稻白葉枯病抗性基因，因其廣譜的抗性而受到廣泛的關注。

1 Xa21的發現、定位及克隆

Khush等［12］發現西非長藥野生稻（Oryza longistaminata）在分蘗后期抗當時菲律賓的全部6個小種。隨后經雜交將其導入感病秈稻品種IR24，通過回交、雜交獲得BC4F2群體，分析其中兩個F2群體對菲律賓小種的抗性遺傳，表明其廣譜抗性由

一對顯性基因控制，為區別于已鑒定的抗性基因，命名為Xa21。后來進一步育成以IR24為遺傳背景攜有Xa21的近等基因系IRBB21。

隨著分子生物學技術的不斷發展和完善，各種DNA分子標記技術包括RFLP、RAPD、SSR等相繼出現，為基因的定位、克隆打下了堅實的基礎。Xa21基因發現后，許多科研工作者紛紛開展其分子標記定位工作。Ronald等［13］首先利用123個DNA標記和985條隨機引物對含有Xa21的近等基因系進行RFLP和RAPD分析發現，位于第11號染色體的標記RG103和引物RAPD248、RAPD818與Xa21共分離，從而將Xa21定位在第11號染色體上；進一步的遺傳作圖表明，3個DNA標記與Xa21的遺傳距離均不超過1.2 cM。隨后，Song等［8］以RG103作為雜交探針從IRBB21的細菌人工染色體（BAC）和柯斯質粒（cosmid）文庫中篩選出7個亞克隆，將亞克隆通過基因槍法導入到感病水稻品種TP309，獲得轉化植株。對轉化植株進行Xoo接種試驗，最后從1 500株轉化植株中篩選出50株轉化植株具有白葉枯病抗性，這50株轉化植株均攜帶有9.6 kb的KpnI亞克隆片段。進一步的試驗發現，9.6 kb的KpnI基因組片段包含一個2.3 kb的HindIII DNA片段是水稻白葉枯病抗性所必需的。序列分析表明，9.6 kb的KpI片段包含一個3 075 bp的ORF以及一個843 bp的內含子，即Xa21基因。

Xa21是水稻第11號染色體上多基因家族的一個成員，該家族包含至少8個成員［8，13］。隨后Song等又從水稻中克隆了6個Xa21基因家族成員，并將7個已克隆成員分別命名為A1、A2、B（Xa21）、C、D、E和F［8，14，15］。

2 Xa21分子生物學特性

2.1 Xa21的表達特征

許多水稻品系對病原菌的抗病反應受水稻發育時期控制［16-19］。Century等［20］發現，Xa21介導的抗性強弱與水稻不同發育時期有關，從幼苗易受感染的2葉期開始至5葉期，Xa21抗性表現逐漸增強，5葉期達到完全抗性的75%（9-10葉期表現完全抗性）；分析水稻不同發育時期Xa21的轉錄水平，結果發現Xa21在不同發育時期的轉錄水平無明顯差異，且不依賴于Xoo侵染或創傷，因此推測Xa21介導的抗病反應調控在轉錄后水平。而Zhao等［21］研究卻發現，Xa21轉錄在水稻2葉期處于低水平，隨發育時期逐漸升高，在分蘗盛期達到最高水平，與Xa21介導的抗性表達結果一致，據此推測Xa21抗性表達與Xa21轉錄水平有關，與Century等的研究結果相矛盾。前者采用的是半定量RT-PCR，而后者采用的靈敏度更高的qRT-PCR，且采取分期種植，同時取樣，降低環境因素的影響，結果更為可靠。

將帶有自身啟動子和玉米啟動子Ubi的Xa21分別導入水稻品種Kitaake獲得轉化植株，檢測轉化植株接種Xoo后不同時間點Xa21的表達，結果表明，Xa21的表達受Xoo侵染或創傷誘導；Ubi啟動子驅動的Xa21呈組成型過量表達；接種試驗表明組成型過量表達Xa21可以克服水稻白葉枯病抗性受發育時期的控制，使其水稻在苗期即表現出較強的抗性［22］。

2.2 編碼產物XA21的生化特性

Xa21編碼產物XA21是一個由1 025個氨基酸組成的類受體蛋白激酶，包括幾個重要部分：LRR，跨膜區，近膜區和胞內激酶結構域［8］。其結構特點前人已進行綜述［23］，在此不再贅述。

XA21的胞內結構域（XA21K）包含絲氨酸-蘇氨酸激酶的所有保守氨基酸殘基特征。體外試驗表明，大腸桿菌中表達的XA21K融合蛋白能夠自磷酸化；磷酸化氨基酸分析結果顯示，只有絲氨酸和蘇氨酸殘基能發生磷酸化，說明XA21K是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；XA21K在含有10 mmol/L錳離子的緩沖液中的活性是含有鎂離子緩沖液的15倍以上；XA21對ATP的Km和Vmax分別是0.4 μm和8.4 nmol（mg·min）；XA21K自磷酸化反應通過分子內機制來實現，并且發生在多個絲氨酸和蘇氨酸殘基。此外，將保守的Lys736殘基置換成谷氨酸導致XA21的自磷酸化功能完全喪失［24，25］。

將野生型XA21和XA21K736E（Lys736置換成Glu736）分別導入水稻品種TP309中，通過免疫共沉淀將XA21和XA21K736E分別從轉基因植株總蛋白中分離出來，進行自磷酸化檢測，結果發現野生型XA21能發生自磷酸化，而XA21K736E不能發生自磷酸化，表明該位點的突變導致XA21激酶功能失

活，進一步的試驗發現該位點的置換導致突變蛋白XA21K736E穩定性降低。磷酸化位點分析表明XA21近膜（JM）結構域的Ser686，Thr688及Ser689殘基均能發生自磷酸化，3個位點同時被丙氨酸置換后導致突變后的蛋白XA21S686A/T688A/S689A穩定性降低。上述結果表明，水稻發育過程中XA21的Ser686，Thr688和Ser689自磷酸化功能對自身穩定性具有保護作用，減弱蛋白酶對XA21的水解作用［26］。

3 Xa21的抗病分子機理

早在20世紀40年代Flor［27］就提出了植物與病原菌互作的“基因對基因（Gene-for-gene）假說”。該假說的建立，為從分子生物學角度解釋寄主抗性奠定了理論基礎［27-29］。植物抗性基因與病原菌無毒基因產物之間互作而產生的抗性是植物抗病性的重要形式。植物模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）識別病原相關分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs），激活體內信號途徑，誘導防衛反應，限制病原物的入侵，這種PRRs對病原物的PAMPs識別引起的植物抗性，稱為植物免疫［30-32］。

3.1 Ax21的鑒定

帶有Xa21的水稻對白葉枯病菌的P6小種表現抗性［8，13］，根據基因對基因假說，P6小種理論上應存在XA21專一性識別的無毒因子（avrXa21）。因此，自Xa21被克隆出來后，avrXa21的鑒定成為研究Xa21抗病分子機制的重要內容。先后從白葉枯病菌P6小種中克隆了8個對avrXa21活性必需的基因［33-35］。根據序列特征和功能，這些基因可分為3類：第一類是硫代謝相關基因，包括raxP、raxQ和raxST；第二類I型分泌系統基因（Type one secretion systems，TOSS），包括raxA、raxB和raxC；第三類雙組分系統基因，包括raxH和raxR。根據影響avrXa21活性的基因產物的功能，推測avrXa21很可能是一個通過I型分泌系統分泌并且硫化的多肽。生物測定avrXa21活性試驗進一步證明avrXa21通過I型而不是III型分泌系統分泌［36］。

Lee等［37］采用反向高效液相色譜法（RP-HPLC）從P6小種的上清培養物中分離并獲得1種能夠引起XA21介導的免疫反應的組分，將該組分通過液相質譜聯用（LC-MS/MS）分析鑒定出8種對應于Xoo的蛋白質共15條多肽，其中2條多肽對應于PXO_03968的N端和C端肽段。分別構建8種蛋白質編碼基因的P6突變體并進行接種試驗，結果發現PXO_03968基因突變后，造成帶有Xa21的水稻感病，最后確定PXO_03968基因編碼avrXa21，并重新命名 為 Ax21（Activator of XA21-mediated immunity）。Ax21由194個氨基酸組成，其N端硫化的17肽（axYs22）是引起水稻白葉枯病抗性的活性多肽，是識別和結合XA21所必需的。

序列分析表明，Ax21同源序列存在于所有已測序的Xanthomonas菌株、苛養木桿菌（Xylella fastidiosa）、嗜麥芽寡養單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） 中；axYS22多 肽 序 列 在 已 測 序Xanthomonas菌株中高度保守，從而確定了Ax21是病原相關分子模式，XA21是模式識別受體，同時也解釋了XA21具有廣譜抗性的原因［37］。

3.2 XA21的作用與調控

激酶包括精氨酸-天冬氨酸（RD）和非RD激酶。RD激酶帶有一個保守的精氨酸殘基位于具有催化性的天冬氨酸殘基前面；而非RD激酶則缺少保守的精氨酸，取而代之的是半胱氨酸或甘氨酸。植物基因組分析顯示水稻基因組存在328個編碼非RD激酶的基因，這些激酶主要位于細胞表面［38］，包括XA26，Pid2及XA21［8，39，40］。動植物細胞表面的模式識別受體（PRRs）通常都帶有非RD激酶或與之相關，從而控制先天免疫信號傳導的早期事件［38，41，42］。模式識別受體FLS2是一個非RD激酶，它通過與RD激酶BAK1互作從而啟動擬南芥防御反應［41］，暗示了XA21可能與RD激酶互作從而介導水稻免疫反應。

XA21家族成員XA21D，缺少跨膜區和激酶結構域，對Xoo的抗性與XA21的抗譜相同，但抗性水平下降。Xa21與Xa21D LRR核苷酸序列具有99%的一致性，暗示XA21的LRR決定了水稻對病原菌種的特異性識別［43］。XA21識別Ax21，從而激活下游的磷酸化反應［4］。有趣的是，XA21胞內激酶結構域保守的Lys736殘基（XA21K736E）突變導致XA21激酶功能失活，但能表現出類似于XA21D

的抗性水平［25］，表明XA21的激酶功能似乎不是介導先天免疫反應所必需的，暗示可能存在與XA21共同發揮功能的調節子。

此外，近膜區的Ser686/Thr688/Ser689殘基突變導致XA21穩定性下降，抗性減弱［25］，以及Thr705殘基突變導致XA21不能自磷酸化［44］等，表明XA21-Ax21的結合通過近膜區的調控來激活非RD激酶結構域，引起XA21自磷酸化和激活下游蛋白，從而介導免疫反應信號傳導。

XA21作用過程復雜，受到多基因的調控。目前，已報道的XA21結合蛋白有XB3［45］、XB10［46］、XB15［47］、XB24［48］和BiP3［49］。XB3具有E3泛素連接酶活性，是XA21蘇氨酸-絲氨酸蛋白激酶的作用底物。當病原菌侵染時，XB3與XA21復合物的形成，促進了XB3的磷酸化，從而引起下游信號及抗病反應，是XA21介導的免疫反應的正調控因子［45］。具有ATP酶活性的XB24能夠結合并促進XA21的自磷酸化。Xb24沉默植株增強XA21介導的免疫反應；反之，Xb24過表達植株則減弱XA21介導的免疫反應［48］。Xb10編碼轉錄因子OsWRKY62，XB10與XA21結合，能夠抑制病原菌誘導的防衛基因表達，從而負調控XA21介導的免疫反應［46，50］。XB15是一類PP2C蛋白磷酸酶，負調控細胞死亡和XA21介導的免疫反應［47］。此外，BiP3是一類內質網伴侶蛋白，過表達Bip3水稻植株導致XA21穩定性降低，蛋白酶裂解被抑制，XA21介導的免疫反應減弱［49］。

3.3 XA21介導的免疫反應模式

2010年，Park等［51］綜合已有的研究結果提出了XA21介導的免疫反應模式：XA21多肽合成后經過內質網加工，然后運輸到質膜后發揮功能。Ax21不存在時，ATP酶XB24結合于XA21的胞內近膜區，促使XA21特定絲氨酸/蘇氨酸殘基發生自磷酸化而處于失活狀態；當Ax21識別并結合到XA21胞外LRR區域時，促使XA21從XB24/XA21蛋白復合體中解離出來，同時激活XA21的非RD激酶域。自磷酸化的Thr705 將磷酰基轉移給XA21的另一個殘基，從而激活了XA21。推測XA21可能將磷酰基團轉移給XB3，從而激活下游的有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）級聯反應，并將信號傳遞到核內WRKY轉錄因子，從而調控防御相關基因的表達。隨后XB15結合到XA21胞內近膜區的Ser697位點，使XA21已磷酸化的氨基酸殘基去磷酸化，從而減弱XA21介導的免疫反應（圖1）。

最近的研究發現，XA21識別Ax21后，其胞內激酶結構域被剪切釋放并定位轉移到細胞核內，這一過程是引起XA21介導的免疫反應所必需的［39］。由于轉錄調節子OsWRKY62（XB10）負調控XA21介導的免疫反應［46］，因此推測位于細胞核的XA21激酶結構域與轉錄調節子結合從而調控轉錄重新編程。雙分子熒光互補（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）分析表明水稻原生質體細胞核內，XA21激酶結構域與轉錄調節子OsWRKY62在細胞核內確實存在直接的相互作用［52］。這些研究結果表明一種新的免疫受體作用模式：受體識別保守的微生物特征標簽，相關激酶轉移到細胞核內直接與轉錄調節子相互作用。

圖1 XA21介導的免疫反應模型［50］

4 展望

Xa21是第一個被克隆的具有廣譜抗性的水稻白葉枯病抗性基因，對其進行深入研究對植物抗病性理論的發展和水稻抗病育種應用均具有重要的指導意義。盡管人們早已認識植物對疾病的抗性反應是R基因與avr基因產物互作的結果，但是關于寄主與病原菌的信號識別、傳遞以及防御反應等復雜過程目前了解較少。研究XA21與Ax21之間的互作對于病原菌與寄主互作模型的建立、互作機理的認識具有十分重要意義。目前，對XA21的分子生物學特性和抗病分子機理等已有較為深入的了解，但還有很多問題未回答。例如，XA21對Xoo的抗性涉及信號通路，具體的調控網絡仍需繼續探索；除了已知的結合蛋白外，XA21是否還存在其他直接作用的靶標，數量有多少；XA21磷酸化是如何激活離子通道和NADPH氧化酶復合體等問題有待進一步研究。盡管Xa21能抗當時印度和菲律賓的所有小種［12］，但是隨著Xa21在抗病育種中的應用，單一抗源的水稻品種在局部地區產生了新的致病菌株，或者地區間不同水稻種質資源與不同病原菌小種的互作常表現出不同的抗性反應。例如，IRBB21對廣東、廣西及浙江等地的白葉枯病小種IV、V及VI均不抵抗［53-55］，因此，IRBB21應慎用于當地的抗白葉枯病育種。聚合多個抗病基因或發掘新的廣譜抗性基因應用于水稻育種具有重要的意義。此外，以高度保守的信號分子Ax21作為藥物靶標應用于水稻白葉枯病防治是一個重要的研究方向。

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（責任編輯 狄艷紅）

Advances of Molecular Biology Researches on Rice Bacterial Blight Disease Resistance Gene Xa21

Chen Xiaolin Yan Qun Gao Lijun Gao Hanliang
（Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests，Plant Protection Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007）

The bacterial blight of rice caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）is one of the most destructive diseases in the world. Up to now, 7 bacterial blight resistance genes have been cloned. Xa21 is the first bacterial blight disease resistance gene cloned from rice and it has drawn great attention because of its broad spectrum resistance against Xoo. This paper briefly reviewed the discovery, mapping, cloning, expression properties of Xa21, biochemical properties, action and regulation of XA21 and XA21-mediated immunity. Future perspective on Xa21-related research were also discussed.

Rice Bacterial blight Resistance gene Xa21

2013-09-10

國家科技支撐計劃子課題（2012BAD19B03），國家現代農業產業技術體系廣西（水稻）創新團隊項目，廣西作物病蟲害生物學重點實驗室基金項目（13-051-47-ST-3），廣西“特聘專家”專項經費資助

陳小林，女，博士，研究方向：病原菌與植物的分子互作；E-mail：56297244@qq.com

高漢亮，男，研究員，研究方向：水稻抗病育種；E-mail：gxdwb2008@163.com