大鯢皮膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)特性及其對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的保護(hù)作用

李林格，曲 敏

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023）

大鯢皮膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)特性及其對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的保護(hù)作用

李林格1，曲 敏2，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023）

研究了大鯢皮膠原蛋白肽結(jié)構(gòu)特性及其對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的保護(hù)作用。大鯢皮經(jīng)胃蛋白酶水解制備膠原蛋白，經(jīng)木瓜蛋白酶水解制備大鯢皮膠原蛋白肽。紫外光譜及紅外光譜結(jié)果表明，大鯢皮膠原蛋白肽具有膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE結(jié)果表明大鯢皮膠原蛋白肽分子量低于55ku。大鯢皮膠原蛋白肽低（50mg/（kg·d））、高（150mg/（kg·d））劑量組可顯著抑制小鼠乙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清中AST、ALT活性的升高，顯著抑制肝組織MDA含量升高，并且抑制肝組織中SOD活性的下降。組織病理表明，乙醇誘導(dǎo)肝損傷模型組小鼠肝細(xì)胞明顯腫脹變形，肝細(xì)胞索紊亂，伴有炎癥細(xì)胞侵潤，大鯢皮膠原蛋白肽各劑量組的肝細(xì)胞排列規(guī)則、肝細(xì)胞索清晰。結(jié)果表明，大鯢皮膠原蛋白肽具有保護(hù)乙醇誘導(dǎo)小鼠肝損傷的作用。

大鯢，皮膚，膠原蛋白肽，乙醇，肝損傷

酒精性肝損傷是一種較為普遍的世界性疾病。酒精對(duì)人體各個(gè)系統(tǒng)如：血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)和心血管系統(tǒng)等產(chǎn)生不同程度的臟器損傷。急性酒精性肝損傷是由于機(jī)體短時(shí)間攝入大量的乙醇，經(jīng)機(jī)體氧化代謝產(chǎn)生乙醛對(duì)肝臟組織的脂肪代謝造成影響造成的。同時(shí)，機(jī)體乙醇代謝大量產(chǎn)生的氧自由基等自由基，造成肝臟細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致?lián)p傷肝組織，進(jìn)而嚴(yán)重影響肝臟蛋白質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)代謝。針對(duì)這一問題，人們致力于從天然食物和藥物中尋找對(duì)酒精肝損傷具有保護(hù)作用的活性物質(zhì)。玉米肽[1]、靈芝肽[2]、牛蒡菊糖[3]等相繼被報(bào)道其對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用。這些結(jié)果表明，肽類、多糖類物質(zhì)是對(duì)酒精肝損傷具有保護(hù)作用活性物質(zhì)的潛在來源。

大鯢（Andrias davidianus）為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。自1999年農(nóng)業(yè)部將大鯢列為重點(diǎn)開發(fā)的養(yǎng)殖品種以來，大鯢人工繁育、養(yǎng)殖技術(shù)獲得了重大突破。2012年大鯢養(yǎng)殖量已經(jīng)突破330萬尾。因此，對(duì)于大鯢的精深加工成為目前的一個(gè)緊迫任務(wù)。目前，未見大鯢膠原蛋白肽肝保護(hù)作用的研究。本文研究大鯢加工副產(chǎn)物大鯢皮制備的膠原蛋白肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的影響，探討大鯢皮膠原蛋白肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的保護(hù)作用，以期為大鯢產(chǎn)業(yè)化副產(chǎn)物的利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢皮 張家界（中國）金馳大鯢生物科技有限公司；清潔級(jí)昆明種小鼠（體質(zhì)量18～22g，雌雄各半）大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXK（遼）2008-0002]；胃蛋白酶（10 000U/g）、木瓜蛋白酶（500000U/g）、SDS（AR）、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán) 北京索萊寶科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒以及考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；硫普羅寧 河南省新誼藥業(yè)股份有限公司。

BS110S分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)；TU-1810紫外可見光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；85-1電磁攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；FD-1冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶法提取大鯢皮膠原蛋白 參照文獻(xiàn)[4]的方法：將大鯢皮解凍，去除皮下脂肪，剪成5mm×5mm小塊，加入5%NaCl水溶液浸泡24h，除去非膠原蛋白成分。蒸餾水洗滌兩次，加入0.5mol/L乙酸溶液（料液比1∶20）以及加入勻漿液0.5%的胃蛋白酶，4℃溶脹12h。溶脹后的大鯢皮，組織搗碎，得到大鯢皮勻漿。勻漿液4℃磁力攪拌提取36h。過濾，濾液9000r/min，離心30min。上清液為大鯢皮酸溶性膠原蛋白粗溶液。上清液中加入NaCl，至NaCl最終溶液濃度為0.9mol/L，過夜，離心收集沉淀。沉淀溶于0.5mol/L乙酸溶液，先用Na2HPO4透析液透析2d，再用蒸餾水透析2d。凍干得大鯢皮酸溶性膠原蛋白。

1.2.2 大鯢皮膠原蛋白肽制備 大鯢皮膠原蛋白濃度30mg/mL，pH調(diào)至6.5，加入0.1%木瓜蛋白酶，水浴溫度45℃反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，大鯢皮膠原蛋白酶解液100℃，加熱10min滅酶。過濾，濾液冷凍干燥得大鯢皮膠原蛋白肽樣品。

1.2.3 SDS-PAGE電泳 根據(jù)Laemmli[5]的方法，分別制備10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定大鯢皮膠原蛋白與大鯢皮膠原蛋白肽。

1.2.4 大鯢皮膠原蛋白、大鯢皮膠原蛋白肽紫外光譜測定 提取的大鯢皮膠原蛋白及膠原蛋白肽樣品溶于0.5mol/L乙酸溶液，配制1g/L溶液。10000r/min，離心30min。測上清液200～400nm紫外吸收光譜。

1.2.5 大鯢皮膠原蛋白肽紅外光譜測定 將樣品與KBr壓制成片，掃描500～4000cm-1波長范圍的光譜吸收值。

1.2.6 肝損傷小鼠及給藥 選昆明種小鼠50只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組和硫普羅寧陽性對(duì)照組（50mg/kg·d），大鯢皮膠原蛋白肽低濃度（50mg/ kg·d）、高濃度（150mg/kg·d）劑量組，每組10只，于12h黑暗，12h光亮的塑料飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，室溫（20±2）℃，濕度40%～60%，自由采食和飲水。各給藥組每天灌胃1次，連續(xù)2周。對(duì)照組和模型組給予同樣量的生理鹽水，于每次給藥3h后，除空白對(duì)照組外，各組均灌胃56度商品二鍋頭16mL/（kg·d）。各組均于末次給藥后禁食不禁水。

乙醇肝損傷小鼠于末次給藥16h后，斷頭取血，在30min內(nèi)，3500r/min，離心5min后得上層血清備用。

快速處死小鼠取肝臟，并在肝左葉組織取約0.3g放冰冷的生理鹽水中漂洗，取出后用濾紙將水吸干，制成10%肝組織勻漿液（生理鹽水的體積總量是組織塊體積的9倍），制備好的10%的肝組織勻漿液在低溫低速離心機(jī)中以2000r/min左右離心10～15min，將離心好的勻漿保留上清液棄沉淀待測[6]。

1.2.7 生化指標(biāo)檢測與病理學(xué)觀察 血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性，肝臟組織中丙二醛（MDA）含量，超氧化物岐化酶（SOD）活性，蛋白質(zhì)含量均按試劑盒的要求進(jìn)行測定。處死小鼠后，取肝臟右葉組織約0.3g，用10%的中性甲醛溶液進(jìn)行固定，石蠟包埋切片。蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察[6]。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)值以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢皮膠原蛋白肽結(jié)構(gòu)特性

圖1 大鯢皮膠原蛋白及大鯢皮膠原蛋白肽SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of collagen and collagen peptides from A.davidianus skin

由圖1可見，所提取的大鯢皮膠原蛋白具有α1、α2和β組分，屬于典型的Ⅰ型膠原蛋白[7]。大鯢膠原蛋白分子量大于100ku。大鯢皮膠原蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶酶解，獲得的大鯢膠原蛋白肽分子量低于55ku。

通過紫外光譜研究發(fā)現(xiàn)，大鯢皮膠原蛋白和膠原蛋白肽均在234nm處出現(xiàn)特征吸收峰（圖2）。這表明大鯢皮膠原蛋白和膠原蛋白肽具有近紫外肽鍵C= O中的電子n→π*躍遷[4]。提取的膠原蛋白和膠原蛋白肽具有相似的紫外吸收光譜，說明木瓜蛋白酶酶解大鯢皮膠原蛋白時(shí)沒有破壞其中具有紫外吸收特征的結(jié)構(gòu)，即大鯢皮膠原蛋白肽仍然符合膠原蛋白的紫外吸收基本特征[4]。

圖2 大鯢皮膠原蛋白和膠原蛋白肽紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectroscopy of collagen and collagen peptides from A.davidianus skin

大鯢皮膠原蛋白及膠原蛋白肽紅外光譜如圖3所示。大鯢皮膠原蛋白（圖3A）和大鯢皮膠原蛋白肽（圖3B）分別在3320.81、3292.61cm-1處具有吸收峰，表明分子中N-H參與氫鍵締合；在3081.73和3080.55cm-1處是酰胺B帶C-N伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰；在2929.34、2961.86cm-1處吸收峰由于酰胺B存在CH2；在1653.26、1655.44cm-1處有強(qiáng)峰由于酰胺Ⅰ帶的CO伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的；在1540.66、1548.25cm-1處具有吸收峰，是由于酰胺Ⅱ帶存在的N-H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的吸收，與膠原蛋白酰胺Ⅱ在1500～1600cm-1有C-N伸縮振動(dòng)以及N-H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰，本質(zhì)為α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲疊加形成吸收帶，同時(shí)Arg，Asp，Glu和Tyr側(cè)鏈在此區(qū)域也有吸收[7]。大鯢皮膠原蛋白（圖3A）和大鯢皮膠原蛋白肽（圖3B）在1451.56和1451.63cm-1處由于存在CH2彎曲產(chǎn)生吸收；在1238.29和1245.60cm-1處存在酰胺III的N-H以及N-H變形出現(xiàn)的吸收峰；在1079.28和1083.15cm-1處吸收峰是由于C-O，C-N-C振動(dòng)產(chǎn)生的；在1653.26和 1655.44cm-1處出現(xiàn)三股螺旋內(nèi)部形成氫鍵的C=O振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰；在1238.29和1245.60cm-1處的吸收是由于甘氨酸及羥脯氨酸形成特有的Gly-Pro-Hyp氨基酸序列出現(xiàn)的紅外特征光譜[7]。

由此可見，提取的大鯢皮膠原蛋白和大鯢皮膠原蛋白肽均具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。胃蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解沒有破壞膠原蛋白中具有的三股螺旋結(jié)構(gòu)，但膠原蛋白肽的分子量明顯變小，說明酶解過程是橫向水解大鯢皮膠原蛋白。大鯢皮膠原蛋白肽是具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的小分子膠原蛋白分子。這對(duì)其具有更好的溶解性及生物活性具有重要作用。

圖3 大鯢皮大鯢皮膠原蛋白和膠原蛋白肽紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of collagen and collagen peptides from A.davidianus skin

2.2 大鯢皮膠原蛋白肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的影響

昆明種小鼠經(jīng)過每天灌胃大鯢皮膠原蛋白肽，連續(xù)2周后斷頭取血分析其生物化學(xué)指標(biāo)，以確定其對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的影響。結(jié)果如表1所示，飼喂大鯢皮膠原蛋白肽組的ALT、AST明顯小于乙醇模型組（p＜0.01）。大鯢皮膠原蛋白肽低劑量及高劑量組與乙醇模型組肝組織中MDA含量相比顯著下降（p＜0.01）。大鯢皮膠原蛋白肽低劑量及高劑量組SOD含量均高于乙醇模型組肝組織中的SOD含量。

各實(shí)驗(yàn)組的肝臟組織病理變化如圖4所示。對(duì)照正常的肝組織切片，乙醇模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，出現(xiàn)大小不等的脂肪滴，伴有炎癥細(xì)胞浸潤；硫普羅寧對(duì)照組，基本與正常肝組織一致，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)較正常；大鯢膠原蛋白肽低劑量組肝組織輕微損傷，肝細(xì)胞輕微腫脹，脂肪滴空泡較乙醇模型組輕；大鯢膠原蛋白肽高劑量組肝組織細(xì)胞正常，肝索排列整齊，與正常肝組織細(xì)胞差別不大。生物化學(xué)指標(biāo)及組織病理結(jié)果表明，大鯢膠原蛋白肽具有明顯減輕乙醇對(duì)肝組織的急性損傷的作用。

表1 大鯢皮膠原蛋白肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠生化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of collagen peptides from A.davidianus skin on biochemical criterion value of alcohol-induced liver injury in mice

圖4 小鼠肝組織病理圖（HE，100×）Fig.4 Histopathological images of the mice liver（HE，100×）

3 結(jié)論

本研究以大鯢皮為原料制備大鯢皮膠原蛋白肽，經(jīng)紫外光譜及紅外光譜結(jié)果表明，大鯢皮膠原蛋白肽具有膠原蛋白類似的三股螺旋結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE結(jié)果表明其分子量低于55ku。大鯢皮膠原蛋白肽低、高劑量組顯著抑制乙醇導(dǎo)致小鼠血清中ALT、AST活性升高，減少肝臟氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，抑制乙醇導(dǎo)致的肝臟中SOD活性下降。組織病理表明，大鯢皮膠原蛋白肽低、高劑量組的肝臟細(xì)胞排列整齊，肝索清晰，脂肪滴空泡減輕，較乙醇模型組肝損傷顯著減輕。大鯢皮膠原蛋白肽具有減輕酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的作用。

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[2]何慧，石燕玲，徐淑芬，等.靈芝肽對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J].食品科學(xué)，2010，31（3）：213-216.

[3]張波，徐永杰.牛蒡菊糖對(duì)亞慢性酒精肝損傷作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（8）：329-331.

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[5]Laemmli UK.Cleavage of structural protein during the assembly of the head of the bacteriophage T4[J]．Nature，1970，277：680-685.

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[7]鐘朝暉，李春美，顧海峰，等.溫度對(duì)魚鱗膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[J].光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（10）：1970-1976.

The structural character of collagen peptides from Andrias davidianus skin and its hepatoprotective effect against alcohol-induced liver injury in mice

LI Lin-ge1，QU Min2，*
（1.College of Life Science，North-East Forest University，Harbin 150040，China；2.Key and Open Laboratory of Aquatic Products Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The present study aimed at evaluating the hepatoprotective effects of collagen peptides from A. davidianus skin against alcohol-induced liver injury in mice.The collagen was extracted from A.davidianus skin by hydrolyzing of pepsin，and collagen peptides were prepared from this collagen by hydrolyzing of papain.The result of ultraviolet absorption spectroscopy and infrared spectra showed that the collagen peptides demonstrated the existence of triple-helix structure.SDS-PAGE showed that its molecular mass was less than 55ku.The liver injury protections were demonstrated by the fact that the increases in activity of liver AST and ALT caused by alcohol in mice treated with low（50mg/（kg·d））and high（150mg/（kg·d））doses of collagen peptides were significantly inhibited while the MDA content was significantly lowered and inhibited reducing of SOD activity as well.Microscopic observations showed that in the alcohol model group，liver cells were markedly swelled and deformed with inordinate liver cell cords and accompanied inflammatory cell infiltration.However，the liver cell cords of mice treated with low and high concentration of collagen peptides were arranged in order，and liver cells were regular arranged.The result indicated that the collagen peptides could be protected alcohol-induced liver injury.

Andrias davidianus；skin；collagen peptides；alcohol；liver injury

TS218

A

1002-0306（2014）08-0340-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.069

2013－09－16 *通訊聯(lián)系人

李林格（1993-），女，大學(xué)本科，研究方向：生物技術(shù)。

遼寧省教育廳科研項(xiàng)目（L2013277）。