納他霉素對鮮切萵苣表面微生物增殖與生理生化變化的影響

宋曉雪，胡文忠，畢 陽，姜愛麗，鄧淑玲，姜燕蓉

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116600）

納他霉素對鮮切萵苣表面微生物增殖與生理生化變化的影響

宋曉雪1，胡文忠2，*，畢 陽1，姜愛麗2，鄧淑玲2，姜燕蓉2

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116600）

為了探討納他霉素處理對鮮切萵苣的保鮮效果，采用濃度為200mg/L納他霉素溶液對新鮮萵苣進行噴霧和浸泡處理，研究了天然保鮮劑-納他霉素對鮮切萵苣表面霉菌生長與生理生化變化的影響。結果表明，納他霉素處理可以有效抑制萵苣表面霉菌的生長與增殖，保持了鮮切萵苣較高的花青素含量，降低了總酚和類黃酮含量降低鮮切萵苣PPO與PAL的活性，抑制了MDA的積累。實驗結果證明納他霉素處理對鮮切萵苣的衰老和腐爛有較好的抑制作用，尤其是噴霧處理的萵苣保鮮效果較好。

鮮切萵苣，納他霉素，微生物，生理生化

萵苣是一種常見的蔬菜，生菜是葉用萵苣的俗稱，屬菊科萵苣屬，通常為一年生或二年生的草本作物，萵苣營養豐富，含水量高達94%～96%，生食脆嫩爽口[1]。隨著人們生活水平的提高和生活節奏的加快，快餐、西餐等行業在我國發展迅速，而鮮切萵苣是各類西式快餐最主要的配菜種類。鮮切萵苣是指以新鮮萵苣為原料，經過篩選、清洗、切絲、脫水、保鮮、包裝等加工過程，經過冷藏運輸后進入配送中心、超市冷柜或者快餐食品企業的即食產品[2]。然而，經過切割等處理后的萵苣組織結構被破壞，汁液外流，易受微生物侵染，并且萵苣內的酶與底物的區域化被破壞，酶和底物直接接觸，發生一系列生理生化反應，如PPO催化酚類物質氧化反應、LOX催化膜脂反應等[3]。

納他霉素是由鏈霉菌發酵生成的一種次級代謝產物，是一種多烯類抗菌素，可以有效抑制霉菌生長，1982年6月，美國食品與藥品管理局（FDA）已正式批準納他霉素作為食品添加劑使用，其無臭無味，不會對人體產生危害，已經成為美國、歐盟、中東及東歐等地區的30多個國家廣泛使用的天然食品生物抗菌劑和防腐劑之一[4-6]。本實驗以新鮮萵苣為原料，采用兩種不同的處理方式研究了納他霉素對鮮切萵苣的微生物增殖、生理生化變化的影響，對萵苣的品質和保鮮效果的影響進行了評價，以期為鮮切萵苣的保鮮提供新的理論依據和技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萵苣 購于大連經濟技術開發區新瑪特超市，選取葉片新鮮無機械損傷，顏色基本一致無病蟲害的萵苣作為實驗材料，購買后立即運回實驗室進行處理；納他霉素、濃鹽酸、氫氧化鈉、甲醇、硼酸、硼砂、PVP、EDTA、β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸、乙酸、乙酸鈉、MPEG、PVPP、Trition X-100、鄰苯二酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等試劑 均為分析純。

AL204型精密電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；Lamda-25型紫外可見分光光度計 美國PE；PAL-1型便攜式速顯糖度計 日本；SIM-F140型制冰機 日本三洋；BR4i型臺式高速冷凍離心機 法國Jouan公司；T-25型勻漿器 德國IKA；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；PCU-CS200ME型組合式氣調冷庫 大連冷凍機股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 萵苣處理 將萵苣用清水洗凈，用鋒利的不銹鋼刀切成2cm寬的絲，將一份樣品于200mg/L的納他霉素溶液中浸泡10min，另一份樣品用200mg/L的納他霉素溶液進行噴霧處理，以去離子水浸泡作為對照組。各處理樣品瀝干后分別裝在經過高壓滅菌的PE塑料托盤中，用25～30μm的聚乙烯保鮮膜密封包裝后放入4℃的冷庫中貯藏，于0、5、10、15d分別測量微生物數量；于0、2、4、6、8、10d分別測定各生化指標，每處理重復3次。

1.2.2 微生物檢測 檢測項目為萵苣表面的霉菌數量，檢測方法按照GB 4789.15-2010，其中對照組和納他霉素處理0d的果實是在浸泡和噴霧后2h晾干后進行平板實驗測得的。

1.2.3 可溶性固形物含量的測定 采用手持式折光儀測定法。取5.0g萵苣樣品放入研缽中充分磨碎，過濾后取汁液進行測定，均以去離子水作為參比進行空白調零，每處理重復三次。

1.2.4 總酚、類黃酮和花青素的測定 參照Pirie and Mullins[7]的方法并作修改。取2.0g萵苣樣品，加入少許經預冷的1%HCl-甲醇溶液，冰浴條件下勻漿后轉入25mL刻度試管中，用1%HCl-甲醇溶液沖洗勻漿管，一并轉移到試管中，定容至20mL，混勻，于4℃避光提取20min，期間搖動數次后過濾，分別于280nm處測定總酚、325nm處測定類黃酮、530nm和600nm處測定花青素，以每克果實在相應處的吸光值為單位，其中花青素含量為530nm和600nm處吸光值之差表示，結果以U/g表示，重復3次。

1.2.5 多酚氧化酶（PPO）活性的測定 參照曹建康[8]的方法并修改。取5.0g萵苣樣品，加入5.0mL 0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH5.5內含4g交聯聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），340mg聚乙二醇6000（PEG6000），1mL Triton X-100），在冰浴條件下勻漿后于4℃、10000×g條件下離心40min，收集上清液為酶提取液，低溫保存備用。取1支試管，加入4mL 50mmol/L、pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和1.0mL 50mmol/L鄰苯二酚溶液，再加入0.1mL酶液，混合后，迅速放入紫外分光光度計中開始掃描10s內398nm處吸光值的變化。結果以ΔOD398nm/min·g表示。重復3次，均以去離子水作為參比空白進行調零。

1.2.6 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定 參照曹建康的方法[8]并修改。取5.0g萵苣樣品，加入5.0mL pH8.8硼酸-硼砂緩沖液，冰浴條件下勻漿后于4℃、10000×g條件下離心40min。取1支試管，加入3mL 50mmol/L、pH8.8硼酸-硼砂緩沖液和0.5mL 20mmol/L L-苯丙氨酸溶液，在37℃預保溫10min，再加入0.5mL酶液，混合后，迅速測定該混合液在290nm處的吸光值作為反應的初始值（OD0）。然后將反應管置于37℃保溫60min。保溫結束時，再立刻測定一次反應混合液在290nm處的吸光值作為反應的終止值（OD1）。均以蒸餾水作為參比空白進行調零。根據保溫前后樣品溶液吸光值的變化，計算PAL活性，重復三次。以每小時每克鮮切生菜樣品（鮮重）酶促反應體系吸光值增加0.01為1個PAL活性單位（U），表示為0.01ΔOD290/（h·g），計算公式如下：

1.2.7 丙二醛（MDA）含量的測定 采用硫代巴比妥法[8]，稱取1.0g萵苣樣品，加入5.0mL 100g/L TCA溶液，研磨成勻漿后，在4℃、12000×g條件下離心20min，收集上清液。取2.0mL上清液，加入2.0mL 0.67% TBA，混合均勻后在沸水中煮沸20min，取出冷卻后再離心一次，分別測定上清液在450、532、600nm波長處的吸光值，空白管中加入2.0mL 100g/L TCA溶液代替提取液。重復三次。按下列公式計算出每克鮮切生菜樣品（鮮重）中丙二醛的含量，用mol/g表示。

式中，c為反應混合液中丙二醛濃度，μmol/L；V為樣品提取液總體積，mL；VS為測定時所取樣品提取液體積，mL；m為樣品質量，g。

1.3 數據處理與分析

實驗數據采用Excel作圖進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 納他霉素處理對鮮切萵苣微生物數量的影響

圖1 納他霉素處理對鮮切萵苣霉菌數量的影響Fig.1 Effect of natamycin on population of molds of fresh-cut lettuces

從圖1可以看出，納他霉素處理可以顯著抑制鮮切萵苣霉菌數量的增加。納他霉素處理的當天霉菌菌落數量迅速下降，采用噴霧處理組的霉菌菌落數量僅為對照組的10.5%，而采用浸泡處理的霉菌菌落數量為對照組的11.2%，說明納他霉素對霉菌的抑制效果明顯，并且在以后的5～15d內采用納他霉素處理的鮮切萵苣表面的霉菌菌落數量均低于對照組，這個結果對于控制鮮切萵苣的腐爛有較為有利的作用。采用噴霧和浸泡處理均有較好的控制霉菌菌落數量的效果，但是采用噴霧處理時的霉菌菌落數量顯著低于對照組（p＜0.05）。

2.2 納他霉素處理對鮮切萵苣可溶性固形物含量的影響

圖2 納他霉素處理對鮮切萵苣可溶性固形物含量的影響Fig.2 Effect of natamycin on the soluable solid content in fresh-cut lettuces

可溶性固形物含量（SSC）是果蔬內所有可溶性化合物的總稱，通常隨著貯藏時間的延長，果蔬逐漸衰老、品質下降，其SSC降低，這主要是植物呼吸作用的消耗所導致的[9]。由圖2可以看出，在整個貯藏期間，總體SCC呈下降的趨勢，并且納他霉素處理組幾乎始終高于對照組。其中在貯藏的第6d，納他霉素噴霧處理組和納他霉素浸泡組SCC分別為1.2%、1.3%，明顯高于對照組的1%，但兩組處理之間無顯著差異（p＜0.05）。實驗結果說明納他霉素處理對延緩鮮切萵苣的SCC下降有較好的作用。

2.3 納他霉素處理對鮮切萵苣總酚、類黃酮和花青素的影響

鮮切萵苣的總酚含量總體呈現先下降后上升的趨勢。由圖3（A）可知，對照組的總酚含量在第4d時降到最低值，降為初始值的35.4%，而后逐步呈現出上升的趨勢。經過納他霉素浸泡處理的鮮切萵苣在第4d降至最低為初始值的14.3%，而納他霉素噴霧處理的鮮切萵苣則在貯藏的第6d降至最低為初始值的23.3%，除在第4d對照組低于納他霉素處理組外，在其他時間均高于處理組，并且都在貯藏的第10d含量達到最大。對比兩種處理發現，納他霉素噴霧處理的鮮切萵苣其總酚含量高于浸泡處理，在第2d時差異最大，噴霧處理比浸泡處理的總酚含量高2.21mg/g。類黃酮和花青素的含量也呈現出先降后升的趨勢。由圖3（B）和圖3（C）可知，鮮切萵苣的類黃酮含量在貯藏的第2d降至最低值、花青素含量在第6d降至最低值，而后都緩慢上升，并都在貯藏的第10d升至最高，經過納他霉素處理的鮮切萵苣其類黃酮含量除第2d外均低于對照組，而納他霉素處理萵苣后的花青素含量均高于對照組，但是各處理組之間并未達到顯著差異水平。

2.4 納他霉素處理對鮮切萵苣多酚氧化酶的影響

圖3 納他霉素處理對鮮切萵苣總酚、類黃酮和花青素含量的影響Fig.3 Effect of natamycin on phenolic compounds，flavonoids and anthocyanin of fresh-cut lettuces

圖4 納他霉素處理對鮮切萵苣PPO活性的影響Fig.4 Effect of natamycin on PPO activity of fresh-cut lettuces

切割處理會引起果蔬PPO活性的普遍升高[10]，由圖4可知，在整個貯藏過程中，鮮切萵苣的PPO活性呈現出先上升后下降的趨勢，但是納他霉素處理組的PPO活性始終低于對照組，并且在貯藏的第6d，對照組的PPO活性達到最大值4.576U/g，而處理組的PPO活性則呈下降趨勢，納他霉素噴霧處理組的PPO活性為1.903U/g，PPO的活性得到明顯抑制，與對照相比差異顯著（p＜0.05），浸泡組的PPO活性為2.176U/g，與對照相比也呈現出顯著差異（p＜0.05）。這表明納他霉素處理能夠有效的抑制鮮切萵苣的PPO活性，并且與浸泡處理相比，噴霧處理的效果要更好。

2.5 納他霉素處理對鮮切萵苣苯丙氨酸解氨酶的影響

圖5 納他霉素處理對鮮切萵苣PAL活性的影響Fig.5 Effect of natamycin on PAL activity of fresh-cut lettuces

植物在受到逆境傷害的時候，植物防衛系統尤其是苯丙烷類代謝被激活，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性迅速上升，所以PAL活性可以作為植物抗逆境能力的一項生理指標[11]。如圖5所示，各處理的PAL活性均呈現出先升后降的趨勢，對照組在貯藏的第4d PAL活性達到最大值為56U/g，比納他霉素噴霧處理組高42.9%，比納他霉素浸泡組高53.6%。在貯藏的第4～8d，與對照相比，納他霉素處理的鮮切萵苣的PAL活性得到明顯抑制，差異顯著（p＜0.05）。在整個貯藏期間，納他霉素處理組的PAL活性均低于對照組，但兩組納他霉素處理之間無顯著差異。

2.6 納他霉素處理對鮮切萵苣丙二醛的影響

圖6 納他霉素處理對鮮切萵苣MDA含量的影響Fig.6 Effect of natamycin on MDA of fresh-cut lettuces

丙二醛是膜脂過氧化作用的主要產物之一，膜脂過氧化的直接結果是膜脂組分改變，丙二醛使膜蛋白交聯聚合，膜相轉為凝膠態，從而破壞膜結構，因此可以作為判斷果實是否進去衰老階段的指標之一[12-13]。由圖6可以看出，隨著貯藏時間的延長，各處理的MDA含量呈上升狀態，并且納他霉素噴霧和浸泡處理組的MDA含量均低于對照組。在貯藏的第6d，對照組與噴霧處理組之間存在顯著性差異（p＜0.05），但和浸泡組之間差異不顯著。說明納他霉素處理可以有效的抑制丙二醛的含量增加，在相同的貯藏條件下，采用噴霧處理更能有效抑制鮮切萵苣膜脂過氧化的程度。

3 結論

納他霉素處理可以較好地降低貯藏期間鮮切萵苣表面的霉菌菌落數量，處理當天就有顯著的抑制效果，并且在貯藏的第6～10d內抑制霉菌數量上升的作用效果也較為明顯，因此納他霉素處理可以有效地控制鮮切萵苣由霉菌引起的腐爛變質；還可以延緩鮮切萵苣的可溶性固形物含量的下降；酚類物質和PPO、PAL等物質都在植物抗病反應中發揮著重要作用，因此認為它們是植物抗病性的生理指標[14-15]。而經過納他霉素處理的鮮切萵苣其總酚含量、類黃酮含量得到抑制，但保持了花青素含量，顯著降低了PPO和PAL的活性，抑制了MDA含量的積累。實驗結果表明：采用200mg/L的納他霉素處理可以較好地保持鮮切萵苣的品質，實驗結果還表明，采用納他霉素噴霧處理的鮮切萵苣優于納他霉素浸泡處理，但是噴霧處理和浸泡處理的差異不顯著。進一步研究可為果蔬保鮮提供理論依據。

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Effect of natamycin on surface microorganism’s growth and physiological properties of fresh-cut lettuces

SONG Xiao-xue1，HU Wen-zhong2，*，BI Yang1，JIANG Ai-li2，DENG Shu-ling2，JIANG Yan-rong2
（1.College of Food Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

The quality of fresh-cut fruits and vegetables decreased rapidly due to cutting-wound damage. Occurrences of decay mainly were caused by microorganism’s growth and reproduction.Natamycin as a natural antifungal biological preservative could inhibit pathogenic molds of fresh-cut fruits and vegetables had been investigated.In this work，fresh-cut lettuces were dipped in and spray with natamycin solution at 200mg/L. These results indicated that fresh-cut lettuces treated with natamycin could be promising in reducing the mols populations，also slowed down the phenolic，flavonoids，anthocyanin degradation and the activity of polyphenol oxidase（PPO），phenylalnine ammonialyase（PAL），inhibiting accumulative of malondialdehyde（MDA）.These results showed that natamycin treatment would delay ripening and inhibit decay of fresh-cut lettuces，fresh-cut lettuces with spray treatment was better than dipped in natamycin solution at 200mg/L.

fresh-cut lettuce；natamycin；microoganism；physiological and biochemical

TS255.3

A

1002-0306（2014）08-0336-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.068

2013－09－24 *通訊聯系人

宋曉雪（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學。

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD38B05）；國家自然科學基金項目（31172009，30972038）；大連市科技計劃項目（2012E13SF106）；大連市金州新區科技計劃項目（2012-A1-049）。