灰樹(shù)花水提物的提取及其抑菌功能

柴瑞娟，孫 晨

（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

灰樹(shù)花水提物的提取及其抑菌功能

柴瑞娟，孫 晨

（安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

為研究水溶液提取灰樹(shù)花營(yíng)養(yǎng)成分，采用水溶液對(duì)灰樹(shù)花多糖進(jìn)行了單因素及正交實(shí)驗(yàn)提取，用苯酚-硫酸法對(duì)多糖進(jìn)行了測(cè)定。并用濾紙片法研究了灰樹(shù)花水提物的抑菌能力。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，影響灰樹(shù)花多糖提取率的因素大小順序依次是：溫度、液料比、提取時(shí)間。灰樹(shù)花多糖的提取最優(yōu)條件為：溫度80℃、液料比60∶1（mL∶g）、提取時(shí)間2.0h。灰樹(shù)花水提物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用，抑菌圈直徑分別為8.74、10.23、12.42mm。

灰樹(shù)花，水提物，正交實(shí)驗(yàn)，多糖，抑菌性能

真菌多糖生物活性復(fù)雜而廣泛，其中，免疫調(diào)節(jié)活性是研究最主要的活性，臨床上真菌多糖可以作為免疫調(diào)節(jié)劑用于免疫性缺陷疾病、自身免疫病和腫瘤等疾病的治療，如香菇多糖可劑量依賴性地提高IL-2和TNF-α的基因表達(dá)水平和活性，這表明香菇多糖可誘導(dǎo)某些免疫反應(yīng)[1]。灰樹(shù)花（Grifola frondosa）屬擔(dān)子菌亞門、多孔菌科，其主要活性成分是灰樹(shù)花多糖，因其有β-（1→6）[2-3]分支，可以抑制腫瘤生長(zhǎng)防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、防止正常細(xì)胞癌變。

目前研究較多的是灰樹(shù)花多糖的提取，傳統(tǒng)的熱水輔以微波[4]、超聲波[5]等手段可以提高灰樹(shù)花多糖的提取率，這些方法適合工廠化或?qū)嶒?yàn)室，現(xiàn)實(shí)生活中，卻難以走進(jìn)普通人家。本文以水提法為基礎(chǔ)，探討提取溫度、液料比和時(shí)間對(duì)灰樹(shù)花水提物浸提率的影響，為日常飲食中灰樹(shù)花多糖的攝取提供參考，因此以水溶性多糖為指標(biāo)表征提取率。灰樹(shù)花提取物可以清除自由基[6]，但其抑菌功能還少見(jiàn)報(bào)道，本文研究了灰樹(shù)花水提物的抑菌性能，為灰樹(shù)花水溶性成分的生理活性研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹(shù)花（Grifola frondosa） 購(gòu)于福建省古田縣大豐工貿(mào)有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球（Staphylococcus aureus） 本實(shí)驗(yàn)室保藏；葡萄糖、95%乙醇、苯酚、濃硫酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；青霉素 華北制藥股份有限公司。

CN0250型電子天平 上海民橋精密科技儀器有限公司；YM30型全自動(dòng)電熱壓力蒸汽消毒器 上海三申醫(yī)療儀器有限公司；250B型數(shù)顯生化培養(yǎng)箱、TGL-16C型高速臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)[7]準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖50mg，蒸餾水定容至100mL，再準(zhǔn)確吸取5mL該溶液，蒸餾水定容至100mL，得25μg/mL的葡萄糖溶液。稱取苯酚6g，溶于蒸餾水并定容至100mL，即得6%苯酚溶液，棕色瓶中避光保存。分別取25μg/mL的葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于空白干凈試管，每管分別加入6%苯酚溶液1.0mL和濃硫酸各5.0mL，用蒸餾水補(bǔ)足到8.0mL后搖勻放置20min。以不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的0號(hào)作為空白調(diào)零，在最大吸收波長(zhǎng)處（490mm）測(cè)定吸光度。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 取6.0g灰樹(shù)花烘干（60℃），粉碎機(jī)粉碎，對(duì)溫度，液料比和提取時(shí)間進(jìn)行多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)。3000r/min離心15min后，得到灰樹(shù)花多糖提取液，稀釋100倍，用移液管取1mL到試管中，依次向試管中加入1.0mL蒸餾水、1.0mL 6%苯酚溶液、5.0mL濃硫酸，利用苯酚硫酸法[8]測(cè)得反應(yīng)后的溶液OD值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出OD值對(duì)應(yīng)的多糖濃度，重復(fù)3次。

1.2.2.1 溫度對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響 液料比40∶1（mL/g），溫度分別為50、60、70、80、90℃，恒溫水浴浸提2.0h研究溫度對(duì)灰樹(shù)花多糖提取的影響。

1.2.2.2 液料比對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響 液料比10∶1、25∶1、40∶1、60∶1、80∶1，60℃的恒溫水浴浸提2.0h，研究液料比對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響。

1.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響 液料比40∶1，60℃恒溫水浴浸提1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，研究提取時(shí)間對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響。

1.2.3 灰樹(shù)花多糖的提取正交實(shí)驗(yàn) 因此根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)三因素的正交實(shí)驗(yàn)，研究灰樹(shù)花多糖的提取，重復(fù)3次。

表1 灰樹(shù)花多糖水提正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Design of the orthogonal test of extracting polysaccharide from Grifola frondosa

1.2.4 灰樹(shù)花水提物的最小抑菌濃度（MIC） 最小抑菌濃度是指抑制某種微生物出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)的最低藥物濃度，可用于定量測(cè)定體外抗菌活性。按正交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取灰樹(shù)花水提物，此水提物為原液，用兩倍法稀釋成1∶2、1∶4、1∶8濃度梯度。采用濾紙片法[9]（直徑6mm）考察原液及不同稀釋度的灰樹(shù)花水提物對(duì)各供試菌的抑菌效果。并用氯化汞（0.3%）、乙醇（75%）、新潔爾滅（1∶2）、青霉素（1.6× 105IU）作相應(yīng)對(duì)比，重復(fù)3次。

1.3 灰樹(shù)花多糖提取率

灰樹(shù)花多糖提取率的計(jì)算式為：

多糖提取率（%）=（多糖濃度（μg/mL）×提取液總體積（mL））/（灰樹(shù)花質(zhì)量（g）×106）×100。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

得回歸方程：y=0.0264x+0.004，r2=0.9990，表明葡萄糖濃度在0～15μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系，可以在此范圍內(nèi)采用上述方法測(cè)定葡萄糖含量。（y為吸光度，x為葡萄糖含量μg/mL）。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 溫度對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響 當(dāng)溫度小于80℃時(shí)，灰樹(shù)花多糖的提取率隨著溫度的升高而增加，80℃時(shí)多糖的提取率最高，而當(dāng)溫度大于80℃時(shí)灰樹(shù)花多糖的提取率有所下降。其原因是：在溫度較低時(shí)，升高溫度可以提高傳質(zhì)效率，有利于多糖的浸提，而當(dāng)溫度高于80℃時(shí)，過(guò)高的溫度會(huì)破壞多糖成分，導(dǎo)致提取率有所下降，與陳欣等[10]報(bào)道類似。高溫（90℃）容易破壞多糖。

圖1 溫度對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

2.2.2 液料比對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響 液料比會(huì)影響溶質(zhì)與提取液的接觸面積，料液比越大，接觸面積越大，多糖就越容易溶出，因此可以看到液料比越大提取率越高。同時(shí)液料比在25∶1和40∶1之間時(shí)灰樹(shù)花多糖的提取率隨著液料比的增大而增加較快，但因?yàn)椴牧现卸嗵呛渴且欢ǖ模?dāng)液料比大于40∶1時(shí)，基本完全溶出，因此多糖的提取率隨著液料比的增大而增加緩慢。

圖2 液料比對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solvent ratio on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

2.2.3 時(shí)間對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響 不同提取時(shí)間條件下灰樹(shù)花多糖的提取率有所不同，并且在實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間條件范圍內(nèi)（1.5～3.0h），灰樹(shù)花多糖的提取率隨著提取時(shí)間的增加而逐漸增加，而當(dāng)提取時(shí)間大于2h時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，灰樹(shù)花多糖的提取率增加緩慢，因?yàn)榻?jīng)過(guò)2.0h的提取多糖已基本完全溶出。

2.3 灰樹(shù)花多糖的提取正交實(shí)驗(yàn)

圖3 時(shí)間對(duì)灰樹(shù)花多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharose from G.frondosa

表2 灰樹(shù)花多糖的提取三因素正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiment

極差分析表明溫度在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)灰樹(shù)花多糖的提取影響相對(duì)較大，液料比在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)灰樹(shù)花多糖的提取影響其次，而提取時(shí)間在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)灰樹(shù)花多糖的提取影響相對(duì)最小。因此，由灰樹(shù)花多糖的提取三因素正交實(shí)驗(yàn)可以確定灰樹(shù)花多糖的提取最優(yōu)條件A3B3C3為：溫度80℃、料液比60∶1、提取時(shí)間2.0h。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

在最優(yōu)條件下進(jìn)行灰樹(shù)花多糖的提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（重復(fù)3次），灰樹(shù)花多糖的平均提取率達(dá)到7.94%，大于極值，因此正交結(jié)果得以驗(yàn)證。

2.5 灰樹(shù)花水提物的抑菌性能

灰樹(shù)花水提物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果較明顯，在1∶8時(shí)即可對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，抑菌圈直徑達(dá)到12.42mm；而對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌作用只有在1∶1時(shí)才會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)，抑菌圈直徑分別為8.74、10.23mm，通過(guò)對(duì)三種細(xì)菌抑菌圈大小的比較可知灰樹(shù)花水提物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌作用最弱。

與化學(xué)物質(zhì)相比，灰樹(shù)花水提物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果大約介于氯化汞（0.3%）和青霉素（1.6× 105IU）之間，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果和青霉素（1.6× 105IU）的抑菌效果接近，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果與氯化汞（0.3%）的抑菌效果相當(dāng)。

表3 灰樹(shù)花水提物的抑菌性能Table 3 Antimicrobial effects about water extract from G.frondosa

表4 四種化學(xué)物質(zhì)的抑菌性能Table 4 Antimicrobial effects about chemical substances

圖4 灰樹(shù)花水提物對(duì)三種細(xì)菌的抑菌圈Fig.4 Antibacterial circle of water extract from G.frondosa to bacteria

3 結(jié)論

目前市場(chǎng)上有多種以多糖為主要成分的保健品或藥品，但一般都價(jià)格昂貴，大眾難以接受。灰樹(shù)花多糖也有同樣的保健和治療功能，且子實(shí)體味道鮮美，因此可通過(guò)日常食用達(dá)到保護(hù)健康的目的。本研究結(jié)果認(rèn)為溫度80℃、液料比60∶1、提取時(shí)間2.0h，可使灰樹(shù)花多糖盡量溶出，即平常食用時(shí)小火慢燉會(huì)更有利于食材的利用。

本研究表明灰樹(shù)花水提物有很好的抑菌效力，但灰樹(shù)花水提物成分復(fù)雜，不僅含有多糖，蛋白，礦質(zhì)離子，還含有揮發(fā)成分[11]。雖然真菌多糖也有一定的抑菌效果[12]，但其他小分子化合物如多酚類[13]也會(huì)有此功能，本研究中灰樹(shù)花水提物的具體抑菌成分還有待探討。

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Water extracts from Grifola frondosa and antimicrobial function

CHAI Rui-juan，SUN Chen
（College of Biochimcal Engineering of Anhui Polytechnic，Wuhu 241000，China）

The purpose of this research was to extract polysaccharide from Grifola frondosa，single factor and orthogonal tests were carried out.The method of phenol-sulfuric acid was used to determine the content of polysaccharide.Antibacterial performance test about water extracts was studied，too.Orthogonal tests showed that optimum conditions of polysaccharide extraction were as follows：extraction temperature 80℃，liquid ratio 60∶1（mL∶g）and extraction time 2.0h.Water extracts from G.frondosa had antibacterial activity to Bacillus subtilis，Escherichia coli and Staphylococcus aureus，and antibacterial circle were 8.74，10.23，12.42mm respectively.

Grifola frondosa；water extracts；orthogonal test；polysaccharide；antimicrobial function

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0299-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.059

2013－07－18

柴瑞娟（1975-），女，碩士研究生，副教授，主要從事微生物學(xué)方面的研究。