紅皮云杉原花青素的配合性質及配合物的抗氧化活性研究

王 萍，鄭洪亮，騰 飛，鄭 影，王振宇，2，*

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150086）

紅皮云杉原花青素的配合性質及配合物的抗氧化活性研究

王 萍1，鄭洪亮1，騰 飛1，鄭 影1，王振宇1，2，*

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150086）

研究了二次純化后的紅皮云杉球果原花青素與金屬離子（Fe2+、Zn2+）螯合、與蛋白質大分子（牛血清蛋白）絡合反應的條件。考察了原花青素濃度、溫度和pH對配合反應的影響，優化了反應條件，并進一步通過體外抗氧化實驗考察了配合體的性質。結果表明，優化后原花青素與Fe2+、Zn2+螯合率分別為89.12%±1.06%、88.31%±0.87%，與牛血清蛋白絡合率為91.78%±1.25%。原花青素經過配合后其生物活性有一定的增強，且不同配合物的生物活性增強程度不同，但均具有較強的ABTS+·、DPPH·的清除能力和還原力，其濃度在一定范圍內與清除能力呈量效關系。

紅皮云杉，原花青素，配合物，抗氧化活性

近年來，隨著人們對環境、生命健康水平等認知程度的不斷提高，人們對天然產物提取物的應用和開發提出了更高的要求。尤其是植物原花青素，因其在植物界分布廣泛，生理功能多樣，來源豐富，已經成為當前研究熱點。據報道，其抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍，是迄今為止發現的最好的天然抗氧化劑之一[1]。原花青素的獨特化學結構賦予其一系列獨特化學性質，使之具有抗腫瘤、抗氧化、抗動脈硬化、防治冠心病與中風等心腦血管疾病以及抗菌等多種生理功能[2-3]，已應用在包括食品、醫藥等許多領域。

目前對原花青素的研究已經成為熱點，但是對于原花青素與金屬離子的螯合反應和與蛋白質、多糖、生物堿等生物大分子的絡合反應的研究卻很少，而在這些反應在現實中卻真實存在的。目前國內在該方面的研究還很匱乏。根據中藥配位化學原理，中藥有機成分與微量元素結合后往往會提高其生物活性或產生新的生物活性。近來研究表明槲皮素與Fe2+、Pb2+、Cd2+等金屬離子形成配合物后生物活性和藥理作用明顯增強[4-7]，這對天然產物的開發利用開辟了新的思路。

紅皮云杉（Picea koraiensis Nakai）是松科云杉屬常綠喬木，分布于東北小興安嶺，吉林山區海拔1400～1800m地帶。本實驗以紅皮云杉球果原花青素的二級純化物為原料，探究其對金屬離子的螯合性能及對

蛋白質生物大分子的絡合反應能力，并對絡合產物進行分離制備；同時采用抗氧化實驗來評價復合反應后配合物的抗氧化能力，旨在為天然產物的開發提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮云杉球果 黑龍江省葦河林業局，采集時間為2011年9月份，將球果鱗片（去掉中間木質軸）低溫干燥后粉碎過80目篩后-20℃密封冷凍，備用；DPPH（2，2-二苯基-1-苦基肼）、Trolox（6-羥基-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-羧酸）、鄰二氮菲

Sigma公司；兒茶素（色譜級） 購自上海源葉公司；FRAP試劑盒、ABTS試劑盒 上海碧云天試劑公司；本乙醇、蒸餾水、氯化亞鐵、鄰二氮菲、無水乙醇、氯化鋅、氯化鈣、香草醛、濃鹽酸、95%乙醇、濃硫酸、30%過氧化氫、甲醇 國產分析純。

RT-6000型酶標儀 深圳雷社生命科技股份有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；XW-80A型旋渦混合器 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GZX-9240ME型數顯鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；FA2004型上海電子天平 上海天平儀器廠；SHB-3型循環水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；TDL-5型臺式離心機 上海科興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兒茶素標準曲線的建立 采用香草醛-硫酸法[8]。 配制兒茶素標準溶液0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27、0.30mg/mL。精確移取1.0mL分別置于10mL試管中，加入2.5mL，4%香草醛-甲醇溶液和2.5mL的30%濃硫酸甲醇溶液，30℃水浴閉光靜置15min。以甲醇代替顯色劑為空白對照，500nm波長下測定其吸光值，平行測樣三次，取平均值。以標準溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，建立標準曲線并擬合回歸方程。

1.2.2 紅皮云杉原花青素二次純化物與金屬離子的螯合反應 紅皮云杉球果原花青素經過大孔樹脂D4020的一次純化，條件為：乙醇洗脫濃度為58%，上樣濃度為2.4mg/mL，徑高比為1∶26，洗脫流速為2.5mL/min；NKA-9大孔樹脂二次純化，條件為：上樣濃度：3.0mg/mL；洗脫劑：60%乙醇；徑高比：1∶25；洗脫劑pH：7，經過兩次純化后純度為73.12%±1.25%，備用。

1.2.2.1 紅皮云杉原花青素二次純化物與Fe2+的鰲合能力測定[9]準確量取1.0mL不同濃度紅皮云杉原花青素二次純化物于10mL比色管中，分別加入2.0mL 2mmol/L的FeSO4溶液，混合均勻后于37℃水浴中保持30min，之后加入0.1%鄰二氮菲溶液0.5mL，混合均勻后于37℃水浴中溫育10min，之后8000r/min離心10min，取上清液于510nm波長處測定吸光度值A1；以等體積蒸餾水代替紅皮云杉原花青素二次純化物，其余方法相同測定吸光度值A0；以等體積蒸餾水代替鄰二氮菲溶液，測定吸光度值A2，以扣除樣品本身的干擾。1%EDTA鰲合劑作為陽性對照，測定方法同上。按照下式計算鰲合率，鰲合率表示加樣后Fe2+的減少量占總Fe2+的百分比：

式中：S：鰲合率，%；A1：混合物吸光度值；A2：上述體系中鄰二氮菲用等體積蒸餾水代替測定吸光度值；A0：上述體系中云杉樣品用等體積蒸餾水代替測定吸光度值。

1.2.2.2 紅皮云杉原花青素二次純化物與Zn2+鰲合能力測定 準確量取0.5mL不同濃度的紅皮云杉原花青素二級純化物于10mL比色管中，分別加入2.0mL 0.015mmol/L的ZnCl2溶液，混合均勻后于37℃水浴中保持30min，之后4000r/min離心5min，取上清液1mL，利用香草醛-硫酸法測定上清液中原花青素濃度，按下式計算出螯合率：

式中：S：鰲合率，%；M0：反應前樣品中原花青素的質量，mg；M1：反應后上清液中原花青素的質量，mg。

1.2.3 紅皮云杉原花青素二次純化物與金屬離子（Fe2+、Zn2+）螯合單因素實驗

1.2.3.1 原花青素濃度對螯合能力的影響 按照實驗方法中定金屬離子的量，螯合溫度為40℃，pH為5，分別以3、4、5、6、7、8、9、10mg/mL的原花青素溶液反應，根據Fe2+/Zn2+螯合能力測定方法，計算各單因素對螯合率的影響，并繪制螯合曲線。

1.2.3.2 螯合溫度對螯合能力的影響 按照實驗方法中金屬離子的量，原花青素濃度8mg/mL，pH為5，分別以螯合溫度20、30、40、50、60、70、80℃反應，根據Fe2+/Zn2+螯合能力測定方法，計算各單因素對螯合率的影響，并繪制螯合曲線。

1.2.3.3 pH對螯合能力的影響 按照實驗方法中金屬離子的量，原花青素濃度8mg/mL，螯合溫度為40℃，分別以pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0反應，根據Fe2+/Zn2+螯合能力測定方法，計算各單因素對螯合率的影響，并繪制螯合曲線。

1.2.4 紅皮云杉原花青素二級純化物與牛血清蛋白的絡合反應

1.2.4.1 紅皮云杉原花青素二級純化物與牛血清蛋白絡合能力測定 稱取牛血清蛋白，配制成濃度約1mg/mL的溶液。將原花青素二級純化物配制成不同濃度（1～8mg/mL），將0.8mL原花青素溶液分別添加到3.5mL牛血清蛋白溶液中，定容至5mL。混合液在35℃中水浴30min，使之形成多酚-蛋白質絡合物。然后于8000r/min離心10min，取離心上清液1mL，用香草醛-硫酸法測定上清液中原花青素的量，參照Zn2+鰲合計算公式得出絡合率。

1.2.5 紅皮云杉原花青素二級純化物與牛血清蛋白絡合的單因素實驗

1.2.5.1 原花青素濃度對絡合能力的影響 按照與牛血清蛋白絡合反應測定方法，螯合溫度為40℃，pH為5，分別以原花青素濃度1、2、3、4、5、6、7、8mg/mL反應，計算各單因素對絡合率的影響，并繪制絡合曲線。

1.2.5.2 螯合溫度對螯合能力的影響 按照與牛血清蛋白絡合反應測定方法，原花青素濃度為3mg/mL，pH為5，分別以螯合溫度20、30、40、50、60、70、80℃反應，計算各單因素對絡合率的影響，并繪制絡合曲線。

1.2.5.3 pH對螯合能力的影響 按照與牛血清蛋白絡合反應測定方法，原花青素濃度為3mg/mL，螯合溫度為40℃，分別以pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0反應，計算各單因素對絡合率的影響，并繪制絡合曲線。

1.2.6 功能評價——原花青素復合體的抗氧化能力

1.2.6.1 原花青素復合體的制備 根據單因素中原花青素二級純化物螯合率曲線圖和絡合率曲線圖，在最佳復合條件下，制備原花青素螯合液和原花青素絡合液，分別用5%NaOH乙醇溶液調節pH，水浴回流攪拌，產生沉淀物，靜置冷卻后過濾，8000r/min離心10min分離，沉淀用無水乙醇洗滌3次，得到粗品，40℃干燥，用于抗氧化實驗。

1.2.6.2 清除DPPH·作用 分別將原花青素復合體溶液配制成濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80μg/mL的溶液。在10.0mL比色管中加入2.0mL樣品溶液，之后加入2.0mL 1×10-3mol/L DPPH·溶液（用95%乙醇配制），搖勻反應30min后于517nm處測定吸光值，以2.0mL無水乙醇與2.0mL樣品液作參比，測定吸光值A，同時以乙醇溶液為參比測定DPPH·空白溶液吸光度值A0，用Trolox作陽性對照，同時做平行實驗[10]。清除率計算公式如下：

以清除率對樣品濃度進行回歸處理，計算出配合物的半數抑制濃度（IC50）數值。

1.2.6.3 總抗氧化能力的測定（FRAP法）標準曲線的準備及總抗氧化能力的測定方法見參考文獻[11]。

1.2.6.4 清除ABTS+自由基作用 樣品的測定方法見參考文獻[12]。計算公式如下：

其中：A1為加測定溶液后ABTS+·的吸光值；A2為測定溶液在734nm波長下的吸光值；A3為未加測定溶液時ABTS+·的吸光值。

2 結果與分析

2.1 兒茶素標準曲線的建立

兒茶素標準曲線見圖1。兒茶素的標準曲線方程為：y＝2.1658x+0.0178，R2=0.9995。

2.2 紅皮云杉原花青素二次純化物與Fe2+的鰲合實驗

2.2.1 原花青素濃度對螯合能力的影響 由圖2可知，隨著原花青素反應濃度的增大，參與反應的原花青素逐漸增多，螯合率也隨之增大[13]，當原花青素的濃度增大到8mg/mL時，溶液中的金屬離子Fe2+完全參加反應，增大原花青素濃度，螯合率基本穩定，故與Fe2+螯合的最適原花青素濃度為8mg/mL。

圖1 兒茶素標準曲線Fig.1 Catechin standard curve

圖2 原花青素濃度對原花青素與Fe2+螯合的影響Fig.2 Effect of quality ratio on coordination of proanthocyanidins on Fe2+

2.2.2 溫度對螯合能力的影響 由圖3可知，隨著反應溫度的增加，20～30℃時，螯合率呈上升趨勢，溫度的增大明顯促進鰲合反應；當溫度超過30℃時，隨著溫度上升，螯合率與溫度呈負相關關系，直到80℃時降至5.64%，可能是由于隨著溫度的升高，原花青素的降解加速，進而導致反應中參與螯合反應的原花青素減少[14]。故選擇30℃為螯合溫度。

圖3 溫度對原花青素與Fe2+螯合的影響Fig.3 Effect of temperature on coordination of proanthocyanidins on Fe2+

2.2.3 pH對螯合能力的影響 由圖4可知，隨著反應體系的pH的變化，在pH為2～6時，螯合率呈上升趨勢，pH的增大明顯促進了鰲合反應；當pH超過6時，隨著pH上升（堿性增強），螯合率明顯下降，因此，原花青素與Fe2+的螯合反應進行的最適體系pH為6。

綜合以上實驗結果，在原花青素濃度為8mg/mL，溫度為30℃，pH為6時做驗證實驗，得到螯合率為89.12%±1.06%。

2.3 紅皮云杉原花青素二次純化物與Zn2+的鰲合實驗2.3.1 原花青素濃度對螯合能力的影響 由圖5可知，隨著反應體系中原花青素濃度增大，在原花青素的濃度在1～5mg/mL時，螯合率基本不變，這是因為此時Zn2+是過量的，體系中固定可反應比例的原花青素全部參與螯合反應；當原花青素濃度超過5mg/mL時，螯合率逐漸下降，這是因為體系中的Zn2+不足，原花青素過剩。從節省原料角度出發，原花青素與Zn2+螯合反應的最佳濃度為5mg/mL。

圖4 pH對原花青素和Fe2+螯合的影響Fig.4 Effect of pH on coordination of proanthocyanidins on Fe2+

圖5 原花青素濃度對原花青素與Zn2+螯合的影響Fig.5 Effect of quality ratio on coordination of proanthocyanidins on Zn2+

2.3.2 溫度對螯合能力的影響 由圖6可知，隨著反應溫度的增加，螯合率在20～40℃時，溫度升高，反應速率加快，螯合率逐漸增大；當溫度超過40℃后，螯合率開始下降，可能是由于溫度較高，原花青素開始降解，進而導致反應中參與螯合的原花青素逐漸減少[15]，當溫度超過70℃后，螯合率下降速率增大，溶液中原花青素被大量破壞，此時螯合率降至最低30.38%，故螯合溫度為40℃。

2.3.3 pH對螯合能力的影響 由圖7可知，隨著反應體系的pH的變化，在pH為2～3時，螯合率變化不大；當pH=4時，螯合率達到了最大61.34%；當pH超過4時，隨著pH上升，螯合率明顯下降。因此原花青素與Zn2+的螯合反應進行的最適體系pH為4。

圖6 溫度對原花青素與Zn2+螯合的影響Fig.6 Effect of temperature on coordination of proanthocyanidins on Zn2+

綜合以上實驗結果，在原花青素濃度為5mg/mL，溫度為40℃，pH為4時做驗證實驗，得到螯合率為88.31%±0.87%。

2.4 紅皮云杉原花青素二次純化物與牛血清蛋白的絡合實驗

2.4.1 原花青素濃度對絡合能力的影響 由圖8可知，原花青素的濃度在1～3mg/mL范圍內，隨著反應體系中原花青素濃度增大，體系中固定可反應比例的原花青素全部參與絡合反應，絡合率基本不變；當原花青素濃度超過3mg/mL時，體系中的牛血清蛋白不足，原花青素剩余，則絡合率逐漸下降。從節省原料角度出發，原花青素與牛血清蛋白絡合反應的最佳濃度為3mg/mL。

圖8 原花青素濃度對原花青素與牛血清蛋白的絡合影響Fig.8 Effect of quality ratio on coordination of proanthocyanidins on Bovine serum albumin

2.4.2 溫度對絡合能力的影響 由圖9可知，隨著體系溫度的上升，絡合率呈現出先上升后下降的趨勢。在20～30℃下，溫度對絡合率的影響情況相同，在此溫度下，絡合率相近。當溫度達到40℃時，絡合率達到最大值，說明牛血清蛋白在該溫度下穩定性較好，能很好的與原花青素進行絡合反應[16]。隨著溫度繼續上升，絡合率呈下降趨勢，是由于在高溫下牛血清蛋白逐漸發生變性，原花青素的結構發生不利變化[17]，導致絡合作用受到影響，說明高溫不利于原花青素和牛血清蛋白絡合反應的進行。因此，原花青素與牛血清蛋白絡合溫度為40℃。

圖9 溫度對原花青素與牛血清蛋白絡合的影響Fig.9 Effect of temperature on coordination of proanthocyanidins on Bovine serum albumin

2.4.3 pH對絡合能力的影響 由圖10可知，隨著反應體系的pH的變化，在pH為2～6時，絡合率呈上升狀態；當pH=6時，絡合率達到了最大值85.61%；當pH超過6時，隨著pH上升（堿性增強），絡合率明顯下降，因此，原花青素與牛血清蛋白的絡合反應進行的最適體系pH為6。

圖10 pH對原花青素與牛血清蛋白的絡合影響Fig.10 Effect of pH on coordination of proanthocyanidins on Bovine serum albumin

綜合以上實驗結果，原花青素濃度為3mg/mL，溫度為40℃，pH為6時做驗證實驗，得到絡合率為（91.78± 1.25）%。

2.5 紅皮云杉原花青素配合物體外抗氧化活性研究

2.5.1 紅皮云杉原花青素配合物清除ABTS+自由基能力的測定 由圖11可知，紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox對ABTS+自由基均有清除作用，在實驗設定的受試物濃度范圍內，隨著樣品濃度的增加，對ABTS+自由基清除的能力逐漸增強。

由結果分析表1可知，各線性模擬方程的關系系數R2＞0.93，說明濃度對清除率的線性關系很好；由IC50值可知，樣品對ABTS+自由基清除能力順序為：Trolox＞原花青素-牛血清蛋白＞原花青素-鋅＞原花青素-鐵（Ⅱ）＞原花青素。說明原花青素經配合后其清除ABTS+自由基的能力有一定的增強。

2.5.2 紅皮云杉原花青素配合物清除DPPH自由基能力的測定 由圖12可知，紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox對DPPH自由基均有清除作用，在實驗設定的受試物濃度范圍內，隨著樣品濃度的增加，對DPPH自由基清除的能力逐漸增強。

圖11 紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox對ABTS+自由基清除作用Fig.11 ABTS radical scavenging activity of proanthocyanidins，coordinated complexes and Trolox

圖12 紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox對DPPH自由基清除作用Fig.12 DPPH radical scavenging activity of proanthocyanidins，Coordinated complexes and Trolox

表1 抗氧化結果分析Table 1 Analysis of antioxidant results

表2 抗氧化結果分析Table 2 Analysis of antioxidant results

表3 抗氧化結果分析Table 3 Analysis of antioxidant results

由結果分析表2可知：線性模擬方程的關系系數R2＞0.93，說明濃度對清除率的線性關系較好；由IC50值可知，樣品對DPPH自由基清除能力順序為：Trolox＞原花青素-鐵（Ⅱ）＞原花青素-鋅＞原花青素-牛血清蛋白＞原花青素。說明原花青素經配合后，其清除DPPH自由基的能力有不同程度的增強。

2.5.3 紅皮云杉原花青素配合物總還原能力的測定

由圖13可知，三種原花青素配合物均有一定的還原能力，且隨著質量濃度的增加還原能力增加。由表3可知，相關系數R2較大，均大于0.99，說明Trolox、原花青素-鋅、原花青素-鐵（Ⅱ）、原花青素、原花青素-牛血清蛋白的還原能力與濃度之間呈現出顯著的相關性。由半效濃度值（EC50值）可知，原花青素與金屬離子配合后，還原能力增強；與牛血清蛋白配合后，還原能力稍有增強。

圖13 紅皮云杉原花青素及其配合物、Trolox總還原能力Fig.13 Reducing power of proanthocyanidins，coordinated complexes and Trolox

3 討論

原花青素是一種良好的氧游離基清除劑和脂質過氧化抑制劑。可有效清除超氧陰離子自由基和羥基自由基[18-20]，也參與磷脂、花生四烯酸的新陳代謝和蛋白質磷酸化，保護脂質不發生過氧化損傷[21]。有研究表明，化合物結構具有較高的超離域度、完整的大P鍵共軛體系、強配位氧原子與合適的空間構型、可作為金屬離子的良好螯合配體，大部分金屬離子最外層都有空軌道，可以形成穩定的配合物[22]。李方等[23]合成了槲皮素鋅、銅和鐵配合物，稱金屬離子與有機活性配體協同作用可提高其抗氧化活性的能力。原花青素為強有力的金屬螯合劑[24]，可螯合金屬離子，將原花青素類化合物與人體必需金屬元素形成配合物，并發揮其抗活性氧自由基的協同增效作用是較為全新的研究領域[25]，而本實驗證實了金屬離子、牛血清蛋白與紅皮云杉球果原花青素配位后抗氧化性增強，而這一研究對天然藥物的開發利用開辟了新的途徑。

4 結論

原花青素與Fe2+螯合的最佳條件為：原花青素濃度為8mg/mL，溫度為30℃，pH為6，在該條件下得到螯合率為89.12%±1.06%。原花青素與Zn2+螯合的最佳條件：原花青素濃度為5mg/mL，溫度為40℃，pH為4，在該條件下得到的螯合率為88.31%±0.87%。原花青素與牛血清蛋白絡合的最佳條件：原花青素濃度為3mg/mL，溫度為40℃，pH為6。在該最佳條件下得到的絡合率為91.78%±1.25%。原花青素與Fe2+、Zn2+、牛血清蛋白的配合體，清除ABTS+·、DPPH·的能力和還原力較原花青素均有一定程度的增強，其中金屬離子配合物增強效果較明顯。

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Coordination characteristics of proanthocyanidins from Picea koraiensis Nakai’s cones and the antioxidant activity of the coordination compound

WANG Ping1，ZHENG Hong-liang1，TENG Fei1，ZHENG Ying1，WANG Zhen-yu1，2，*
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.College of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150086，China）

The coordination of second purified proanthocyanidins with Fe2+，Zn2+and bovine serum albumin was studied.The effect of proanthocyanidins concentration，temperature and pH on coordination characteristics was investigated and the coordination conditions were optimized.The antioxidant activity of the coordination compound was evaluated.Results showed that the rate of proanthocyanidins coordinated with Fe2+，Zn2+and bovine serum albumin was 89.12%±1.06%，88.31%±0.87%and 91.78%±1.25%respectively under the optimized conditions.The physiological activity of proanthocyanidins increased after coordinated.The activity of scavenging free radicals and reducing power were enhanced.A dose-response relation between concentrations and antioxidant activity was found，for which a good development prospects was expected.

Picea koraiensis Nakai；proanthocyanidins；coordinated complexes；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2014）08-0276-07

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.054

2013－09－02 *通訊聯系人

王萍（1964-），女，教授，研究方向：功能性植物資源的開發與利用。

國家自然基金資助項目（31170510）。