應用響應面法優化黑曲霉固態發酵稻谷殼產木聚糖酶條件

鄭虹

（福建師范大學福清分校生物與化學工程系，福建福清350300）

應用響應面法優化黑曲霉固態發酵稻谷殼產木聚糖酶條件

鄭虹

（福建師范大學福清分校生物與化學工程系，福建福清350300）

對黑曲霉產木聚糖酶發酵工藝進行優化研究。在單因素實驗的基礎上，采用Box-Benhnken實驗設計，對黑曲霉發酵稻谷殼產木聚糖酶的最佳碳源及其添加量、培養時間、水的添加量進行優化，建立了木聚糖酶產量隨蔗糖添加量、培養時間和水的添加量變化的多項二次回歸方程，并得到最佳的發酵工藝條件是：培養時間為78h，水的添加量為57%，蔗糖添加量為1.3g時，木聚糖酶的酶活力可達221.5U/g，比優化前提高了1.76倍，預測模型可靠，可利用該模型對黑曲霉產木聚糖酶的最優發酵條件進行理論預測。

黑曲霉，木聚糖酶，固態發酵，Box-Benhnken實驗設計

木聚糖酶（Xylanase）是指將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括外切β-1，4-木聚糖酶，內切β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶[1-2]，其中內切β-1，4-D-木聚糖酶（endo-β-1，4-D-xylanase）（EC.3.2.1.8）是木聚糖降解酶系中最關鍵的酶，該酶在飼料、食品、造紙、紡織、醫藥及能源等領域有著廣泛的應用[3-5]。

微生物、動物、植物均能生產木聚糖酶，而微生物由于其生長快、便于提純，是木聚糖酶的主要來源。目前，自然界中已知能產木聚糖酶的微生物主要有真菌、放線菌、細菌、酵母菌、藻類等[3]。國內研究較多的是木霉、青霉、黑曲霉等霉菌[6-7]。其中由于黑曲霉具有生長迅速、發酵周期短，發酵過程中不產生毒素等優點，在木聚糖酶的大規模生產中備受人們的關注[8]。

在木聚糖酶生產中，麩皮、麥稈、玉米芯、稻稈、甘蔗渣等農業廢棄物是常見的木聚糖酶誘導物[9-10]，也有人以豆皮[11]為原料對黑曲霉產木聚糖酶的發酵條件進行研究，目前國內研究較多的是以玉米芯、麩皮作為產木聚糖酶的原料[12]，而以稻谷殼作為其發酵介質目前還未見報道。本研究以稻谷殼作為黑曲霉產木聚糖酶的培養介質，并在單因素基礎上，運用響應面分析方法優化其培養條件，為今后的放大研究提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉 本實驗室保藏；斜面培養基 馬鈴薯瓊脂培養基（PDA培養基）；液體種子培養基 稻谷殼2g，葡萄糖3g，（NH4）2SO41.5g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O 0.05g，pH6.0，水100mL；固體發酵培養基 250mL三角瓶中加入10g稻谷殼，再加入10mL蒸餾水，攪拌均勻，121℃滅菌30min。

SPX-150B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SWCJ-IFD型超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；THZ-25型大容量恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠；BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；DZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；H1850R型高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；7200型可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 操作流程 4℃冰箱保存的菌株接種于新鮮試管斜面，30℃培養5～7d，加入無菌生理鹽水，刮下孢子并稀釋至孢子液濃度為107個/mL。取5mL孢子懸液接入100mL種子培養基，30℃120r/min振蕩培養3d。再按10%接種量接種于固體發酵培養基，攪拌均勻，30℃靜止培養，取樣測酶活。

1.2.2 粗酶液的制備 將黑曲霉固態發酵后的培養物在50℃下烘24h后，稱取1.0g培養物，加蒸餾水20mL，置于搖床（120r/min，30℃）中浸提1h后，4℃4000r/min離心5min，上清液即為粗酶液。

1.2.3 木聚糖酶活力測定方法 采用DNS法[13-15]。

1.2.3.1 標準曲線的制作 將烘至恒重的木糖用蒸餾水配制成濃度為1mg/mL的母液，4℃冰箱保存。按表1順序加入各試劑，沸水浴保溫5min，迅速冷卻至室溫，最后定容至25mL。定容后將以上各管溶液混合均勻，用1#管調零點，于λ=540nm處測吸光值，以木糖含量為橫坐標，OD540為縱坐標繪制出標準曲線，結果見圖1。

表1 木糖標準曲線的制作Table 1 Facture of standard curve of xylose

圖1 木糖標準曲線的繪制Fig.1 Standard curve of xylose

1.2.3.2 樣品中酶活力的測定 在25mL容量瓶中加入1.8mL 1%木聚糖底物溶液，50℃水浴鍋中保溫5min后，加入0.2mL適當稀釋的酶液，充分混勻，50℃水浴15min，立即加入1.5mL DNS試劑并混合均勻，沸水浴5min顯色，迅速冷卻，最后以蒸餾水定容至25mL。以滅活酶液為空白管作為對照。測定λ= 540nm處的OD值。每個實驗做3個重復，每個重復測3次酶活。

酶活單位定義為：以木聚糖為底物，每分鐘釋放1μmol相當于木糖的還原糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。酶活力計算公式如下：

酶活力（U/g）=W×N×1000/（M×T×V）

式中：W—酶解反應產生的木糖量（mg），從木糖標準曲線上查得；N—酶液稀釋倍數；M—木糖分子量，150.13g/mol；T—反應時間（min），15min；V—酶用量（mL），0.2mL。

1.3 實驗設計

1.3.1 單因素實驗設計

1.3.1.1 不同碳源的單因素實驗 在基礎固體發酵培養基中分別加入2%的碳源（乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na））。

1.3.1.2 蔗糖添加量的單因素實驗 在基礎固體發酵培養基中加入不同濃度的蔗糖，100mL發酵培養基中蔗糖含量分別為0.5、1、1.5、2、2.5、3g，取樣測酶活。

1.3.1.3 培養時間的單因素實驗 制備基礎固體發酵培養基，滅菌接種后，30℃恒溫培養，每隔12h取樣測定發酵物的木聚糖酶含量，即24、36、48、60、72、84、96h取樣測定其酶活。

1.3.1.4 水的添加量的單因素實驗 配制不同水的添加量的基礎固體發酵培養基，水的添加量分別為45%、50%、55%、60%、65%、70%。

1.3.2 響應面實驗設計 采用Design Expert 8.05軟件設計實驗[16-18]。采用Box-Benhnken的中心組合實驗設計，在單因素實驗基礎上，選取蔗糖添加量、培養時間、水的添加量3個因子，設計3因素3水平的響應面分析實驗，因素及水平見表2。

表2 響應面實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 碳源對黑曲霉產木聚糖酶量的影響 在基礎固態發酵培養基中加入不同的碳源，培養72h后測定其酶活，結果見圖2。

基礎發酵培養基是以稻谷殼作為培養基質，稻谷殼的主要成分是木質素、木纖維，而蛋白質及脂類物質含量較低，高含量的木質素有利于黑曲霉誘導合成木聚糖酶，外加碳源的目的主要是為菌體提供生長養分。由圖2可見，添加有2%蔗糖的基礎發酵培養基，木聚糖酶的產量最高，可達156.67U/g，而可溶性淀粉的產酶量最低，只有111.70U/g，黑曲霉對幾種實驗碳源的利用順序為：蔗糖＞葡萄糖＞CMC-Na＞乳糖＞可溶性淀粉?？赡苁且驗楹谇箤φ崽?、葡萄糖等高效碳源利用率較高，有利于菌體生長，進而有利于木聚糖酶的積累，而黑曲霉對淀粉利用低，菌體生長不好，因此也不利于木聚糖酶的積累。

圖2 不同碳源對產木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of carbon sourse on xylanase production

2.1.2 蔗糖添加量對黑曲霉產木聚糖酶量的影響 在基礎固態發酵培養基中加入不同克數的蔗糖，培養72h后測定其酶活，結果見圖3。

圖3 蔗糖添加量對產木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of sucrose concentration on xylanase production

由圖3可見，不同濃度的蔗糖添加量對菌株產木聚糖酶有明顯的影響，木聚糖酶的產量隨蔗糖添加量的增加呈先增后減的趨勢，當蔗糖添加為1.5g時，產酶量達到最大值，即162.73U/g。每一種微生物都有自身最適的碳氮源添加量，太高太低都不利于菌體或其代謝產物的產生。太低的蔗糖含量，不利于菌體生長，進而影響微生物合成木聚糖酶，而太高的蔗糖添加量，也不利于木聚糖酶的積累，因此最適的蔗糖添加量為每100mL發酵液中蔗糖添加量為1.5g。

2.1.3 培養時間對黑曲霉產木聚糖酶的影響 在基礎固態發酵培養基中接入黑曲霉孢子懸液，分別培養至24、36、48、60、72、84、96h后測定發酵物中木聚糖酶的酶活，實驗結果見圖4。

微生物積累產物的過程是一個動態的過程，一般產物都是隨著培養時間的增加而增加，但是到了培養后期，隨著菌體進入衰亡期及營養物質的消耗，產物的積累速度也慢慢減少。由圖4可見，木聚糖酶的產量先是隨著培養時間的增加而逐漸增加，當培養時間達到72h時，產酶達到最大值，即135.6U/g，之后木聚糖酶產量反而隨著培養時間的增加而逐漸下降。故黑曲霉固態發酵稻谷殼產木聚糖酶的最佳培養時間為72h。

圖4 培養時間對產木聚糖酶的影響Fig.4 Effect of culture time on xylanase production

2.1.4 水的添加量對黑曲霉產木聚糖酶量的影響 對于固體發酵來說，最主要的影響因素就是發酵培養基的水的添加量，多數固態發酵的水的添加量是控制在30%～85%，太高或太低水的添加量都不利于菌體的生長和產物的積累，因此選擇適宜的水的添加量對黑曲霉產木聚糖酶是一個非常重要的因素之一。

圖5 不同水的添加量對產木聚糖酶的影響Fig.5 Effect of water content on xylanase production

由圖5可見，黑曲霉木聚糖酶的產量隨著水的添加量的增加而增加，當水的添加量為55%時，木聚糖酶的酶活達到最高，即146.8U/g，之后，黑曲霉的產酶量反而隨著水的添加量的增加而遞減。培養基質不同，所需的水的添加量也有很大的差異，本實驗所采用的培養基質是稻谷殼，稻谷殼具有較高的通氣性，而且比較粗糙，不易吸水，固體培養時需要有一定的濕度，才有利于酶的產生，培養基水的添加量太高或太低都不利于木聚糖酶的產生，因此，黑曲霉固態發酵稻谷殼產木聚糖酶的最佳水的添加量為55%。

2.2 響應面分析法優化發酵工藝

2.2.1 二次回歸擬合 根據單因素實驗結果，選擇蔗糖添加量（X1）、培養時間（X2）、水的添加量（X3）3個因素為變量，木聚糖酶酶活力為響應值Y，設計3因素3水平的響應面分析實驗，實驗方案及結果見表3。

表3 Box-Benhnken實驗設計與結果Table 3 Design and results of Box-Benhnken experimental

利用軟件對表3數據進行二次多項回歸擬合，獲得二次多項回歸方程：

Y=216.89-8.32X1+1.33X2+11.57X3-19.09X1X2+ 9.41X1X3+11.88X2X3-18.01X12-12.45X22-21.51X32

2.2.2 回歸模型的方差分析 對上述回歸模型進行方差分析，結果見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the regression model

由表4回歸模型的方差分析可知，回歸模型的p= 0.0087，失擬p=0.4801，回歸顯著，失擬不顯著，說明所創建的模式合適。該模型的校正系數Adj R2=0.7731，說明該方程與實際情況擬合較好，預測值和實際值的相關性較高，可用該模型對黑曲霉產木聚糖酶的最優發酵條件進行理論預測。

由回歸方程各項方差分析表明，X3、X1X2、X12對黑曲霉產酶量影響顯著，X32酶活力影響極顯著，其余因子的影響均不顯著。由軟件分析得出模型的極值點，當蔗糖添加量1.28g，培養時間為78.46h，水的添加量為56.62%時，黑曲霉產木聚糖酶理論預測最大值為220.92U/g。

2.2.3 回歸模型的響應面圖 利用軟件Design Expert 8.05繪制出響應面分析圖。結果見圖6～圖8。

圖6 培養時間和蔗糖的添加量對木聚糖酶產量影響的響應面圖Fig.6 Pesponse surface for the effect of cross-interaction between fermentation time and sucrose content on xylanase production

圖7 水和蔗糖的添加量對木聚糖酶產量影響的響應面圖Fig.7 Pesponse surface for the effect of cross-interaction between water and sucrose content on xylanase production

圖8 水的添加量和培養時間對木聚糖酶產量影響的響應面圖Fig.8 Pesponse surface for the effect of cross-interaction between water content and fermentation time on xylanase production

由圖6可見，當X1較小時，酶活隨X2的增加而增加；當X1較大時，酶活隨X2的增加而短暫增加后降低；X1的變化趨勢X2完全一致。當蔗糖添加量為1.5g、培養時間為72h時，木聚糖酶活力達到最高221.32U/g。蔗糖添加量與培養時間的等高線呈橢圓形，表明二者交互作用顯著。圖7顯示木聚糖酶產量隨X1、X3的增大呈先增后減的趨勢，當蔗糖添加量為1.5g、水的添加量為55%時，木聚糖酶活力達到最高221.32U/g。蔗糖添加量與水的添加量的等高線呈圓形，但二者交互作用不顯著。由圖8可見，木聚糖酶隨X2、X3的增大呈先增后減的趨勢，當培養時間為72h、水的添加量為55%時，木聚糖酶活力達到最高221.32U/g。

2.3 回歸模型的驗證實驗

為實際操作的可行性，將以上理論組合校正為：蔗糖添加量1.3g，培養時間為78h，水的添加量為57%，此時木聚糖酶活力可達到221.5U/g，產酶量比優化前（125.59U/g）提高了1.76倍，與理論預測值（220.92U/g）較為接近，表明預測值與實際值有較好的擬合性，可見該模型可用于預測黑曲霉產木聚糖酶的實際發酵情況。

3 結論

在單因素基礎上，采用響應面法對黑曲霉產木聚糖酶的發酵條件進行優化，并建立了產酶量與蔗糖添加量、培養時間及水的添加量之間的二次多項回歸模型，得出最優發酵條件為蔗糖添加量1.3g，培養時間為78h，水的添加量為57%，在此條件下，木聚糖酶的產量達到221.5U/g，比優化前提高了1.76倍。

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Study on optimization of the rice crust solid-state fermentation for xylanase from Aspergillus niger by response surface method

ZHENG Hong
（Biology and Chemistry Engineering Department，Fuqing Branch of Fujian Normal University，Fuqing 350300，China）

In this study，the fermentation technology of xylanase produced by Aspergillus niger in solid-state fermentation using rice crust as a sole substrate was investigated.On the basis of single factor experiment，the best carbon source，fermentation time and content of water for xylanase production by Aspergillus niger were optimized by Box-Benhnken design，and a quadratic regression equation for the change of enzymic activity with soluble starch，fermentation time，the content of water was established.The results showed that the optimal conditions were fermentation time for 78h，the content of water 57%，soluble starch 1.3g.Under optimization conditions，xylanase activity reached 221.5U/g，increased 1.76 times than before optimization.The prediction model indicated high reliability，which could be applied to optimization of xylanase fermentation conditions.

Aspergillus niger；xylanase；solid-state；Box-Benhnken experiment design

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0210-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.039

2013－07－31

鄭虹（1981-），女，碩士研究生，實驗師，研究方向：微生物。

福建師范大學福清分校校級重點學科建設基金項目（20110346）；省教育廳A類項目（JA12358）。