濃香型白酒釀造相關酵母與發酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的相關性

王 濤，李謹萌，游 玲，袁 浩，馮學愚，曹子建，*

（1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644000；2.發酵資源與應用省高校重點實驗室，四川宜賓644000；3.成都師范學院，四川成都610041）

濃香型白酒釀造相關酵母與發酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的相關性

王 濤1，李謹萌1，游 玲2，袁 浩1，馮學愚3，曹子建3，*

（1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644000；2.發酵資源與應用省高校重點實驗室，四川宜賓644000；3.成都師范學院，四川成都610041）

為探討濃香型白酒釀造過程中酵母與乙酸乙酯及乙酸生成的關系，將分離自濃香型釀造諸環節的122株酵母分別接種至半固體培養基（入窖糧糟+黃水）中發酵，并設立空白對照和窖內對照，75d后測定糟醅中乙酸乙酯和乙酸的含量。結果顯示，122株酵母中能夠使糟醅中乙酸乙酯含量高于2個對照的菌株分別有84株和54株，其中乙酸乙酯含量最高可達3.74g/L，為窖內對照的3.94倍；使乙酸含量低于2個對照的分別有120株和15株，其中乙酸含量最低僅為2.03×10-4g/L，僅為窖內對照的0.13%；122株酵母所對應的糟醅中乙酸乙酯、乙酸的濃度間不存在明顯的對應關系。

濃香型白酒，乙酸乙酯，乙酸，酵母菌

濃香型白酒的窖內發酵主要依賴于生產環境、曲藥、窖泥內眾多微生物的參與，微生物的代謝產物、高分子化合物的降解產物及它們之間相互反應的產物構成了白酒的呈香呈味物質，其種類、含量及協調的比例決定了產品品質[1]。乙酸乙酯是濃香型白酒四大骨架酯之一，也是清香型白酒的主體呈香呈味物質[2]。目前對濃香型白酒中乙酸乙酯的相關研究主要集中在生產工藝與原酒中乙酸乙酯含量[3-4]、產乙酸乙酯的功能微生物的篩選及初步應用[5-7]等方面，但對乙酸乙酯在窖內的生成機理研究不夠深入。同時，濃香型白酒的各種有機酸中，乙酸含量最高[8]，且是丁酸、己酸及其酯類的重要前體物質[9]，但乙酸含量過高會對發酵中的酵母產生毒害作用，進而影響產品質量[10]。

本文通過對分別接種了分離自濃香型白酒釀造環境的122株酵母并在窖外發酵后的糟醅、空白對照和窖內對照的糟醅中乙酸乙酯和乙酸含量的進行了比較，以期篩選到一些具有生產應用前景的酵母，并在一定層面反映釀造環境中酵母區系與發酵糟醅中生物和非生物因子的互作關系，也為進一步解析濃香型白酒中物質代謝關系提供一些基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料 2008年以來，將分離自濃香型白酒生產企業釀造諸環節的菌株，通過菌落和細胞表觀特征去除了冗余的后得到122株酵母，現保存于發酵資源與應用四川省高校重點實驗室。其中，分離自糟醅58株、窖房空氣38株、曲房空氣16株、窖泥4株、大曲6株，經基于26S rDNA D1/D2區的系統發育分析，101株分屬于11個屬，21株酵母尚未確定其分類地位（結果另發）；乙酸乙酯、乙酸 均為分析純，鄭州譜析公司。

GCMS-QP 2010 PLUS 日本島津。

1.2 培養基和入窖糟醅制備

1.2.1 培養基 YPD固體和液體培養基。

1.2.2 入窖糧糟 2011年4月采自四川某知名酒企的多糧濃香型入窖糧糟（“跑窖法”工藝，添加了20%曲粉）。

1.2.3 黃水 取自入窖糧糟上一輪發酵的窖池。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化 菌株經YPD活化后，無菌水調整至108個/mL，4℃保存備用。

1.3.2 接種與發酵 在釀造車間內將入窖糧糟和原窖黃水按約50∶1的體積比混勻后，分裝至500mL無菌三角瓶中（每瓶裝400g糟醅），無菌密封后立即回實驗室接種。每株菌接種2瓶（10mL/瓶），以不接種酵母的糟醅為空白對照（2瓶）。三角瓶用橡膠塞及保鮮膜封口后常溫遮光發酵75d（發酵時間為4月13日～6月27日）。以同批次正常入窖發酵（75d）的糟醅為窖內對照。

1.3.3 檢測樣品的制備 每個三角瓶取糟醅200g（糟醅混勻后再取樣，每個樣處理后單獨檢測取平均值），窖內對照取樣1000g（多點取樣、混合均勻），加等體積蒸餾水蒸餾，取100mL餾分用0.22μm細菌濾膜過濾后GC-MS檢測，并以1.1466g/L的乙酸乙酯溶液和0.4915g/L乙酸溶液作為標樣，以作確認。

1.3.4 GC-MS檢測 色譜條件：色譜柱為LZP-930（5000mm×0.25mm×0.25μm）毛細管柱，載氣為高純氦氣，柱溫50℃（保持3min），以5℃/min的速率升溫至150℃（保持5min）；以5℃/min的速率升溫至190℃（保持5min），以3℃/min的速率升溫至220℃（保持10min）；進樣口溫度220℃，進樣量0.2μL，分流比30∶1。

質譜條件：電離源EI，電子能量70eV；離子源溫度200℃，檢測溫度240℃，溶劑延遲3min，掃描范圍30～550amu，倍增電壓1.2kV。

2 結果與分析

2.1 糟醅發酵情況

三角瓶中的糟醅發酵結束時呈潤濕、均一的黃褐色，無霉菌污染，整體發酵情況良好。對照窖池出窖糟醅和原酒的感官、理化指標均顯示窖內發酵糟醅發酵正常。

2.2 發酵糟醅中乙酸含量

經GC-MS檢測，空白對照和窖內對照乙酸濃度分別為10.53g/L和0.15g/L，窖內發酵糟醅乙酸濃度與實際生產和文獻報道[9]基本一致。這也顯示窖內發酵能夠顯著降低糟醅中乙酸的含量。122株供試酵母中有120株酵母對應的糟醅中乙酸濃度低于空白對照（占供試菌株的98.36%），其中15株對應的糟醅還低于窖內對照（占供試菌株的12.30%）。這表明在濃香型白酒釀造環境中的酵母絕大多數都能夠降低發酵糟醅中的乙酸含量。

所有發酵糟醅中，乙酸濃度最高和最低值分別為14.62g/L（為窖內對照的97～98倍）和2.01×10-4g/L（僅為窖內對照的0.00134倍），為分別接種了分離自發酵糟醅和窖房空氣的2株Debaryomyces屬酵母的糟醅。這顯示供試酵母對發酵糟醅中乙酸濃度的影響能力差異巨大，也在一定程度上說明濃香型白酒發酵體系的復雜性。

2.3 發酵糟醅乙酸乙酯含量

窖內對照糟醅中乙酸乙酯濃度為0.95g/L，這與實際生產和文獻報道[11]基本一致，且高于空白對照（0.46g/L）。84株（占供試菌株的68.85%）對應糟醅中乙酸乙酯濃度高于空白對照，有54株對應糟醅中乙酸乙酯含量高于窖內對照。同時接種了酵母樣品中乙酸乙酯的平均濃度為1.06g/L，為空白對照的2.32倍。這也顯示濃香型白酒釀造相關環境中的酵母區系總體上能夠促進發酵糟醅產生乙酸乙酯。

同樣，供試酵母對發酵糟醅中乙酸乙酯濃度的影響能力也差異巨大。接種了1株分離自曲房空氣的Pichia屬酵母的糟醅中乙酸乙酯含量最高，達到了3.74g/L，分別是空白對照和窖內對照的8.20倍和3.92倍；接種了1株分離自糟醅的Wickerhamomyces的樣品中乙酸乙酯含量最低，僅為4.12×10-4g/L。

2.4 降低（增加）糟醅中乙酸（乙酸乙酯）含量最為明顯的酵母

由于供試酵母數量較多，僅選擇了對應糟醅中乙酸乙酯濃度最高的10株酵母和乙酸濃度最低的10株酵母進行了分析。

從表1可以看出，10個樣品中乙酸乙酯含量最低為2.70g/L，遠高于窖內對照（0.95g/L），這顯示這些菌株均有在濃香型白酒生產中應用以提高產品中乙酸乙酯含量的潛力。從10株酵母分別分離自窖房空氣（5株）、發酵糟醅（4株）和曲房空氣（1株），無論從絕對數量還是相對數量來看，分離自窖房的菌株都最多。這顯示窖房空氣中的酵母對促進糟醅中的乙酸乙酯含量增加有重要的作用，也從側面反映窖房空氣中的微生物區系對于濃香型白酒釀造具有重要作用。但從10株酵母的分類地位來看，能夠促進發酵糟醅中乙酸乙酯顯著增加的酵母沒有種屬特異性。從10個樣品中乙酸乙酯和乙酸含量的比例來看，糟醅中2種物質的含量沒有對應關系。

從表2可以看出，這10個樣品中乙酸含量均遠低于窖內對照和空白對照。10個樣品對應的菌株中分離自窖房空氣的最多（4株），其次為糟醅（4株）、窖泥和曲房空氣（各1株）。這也在一定程度顯示了生產車間空氣中的酵母區系通過在攤晾過程接種于糟醅，在窖內發酵中扮演著重要的作用。10株酵母中，Debaryomyces屬最多（6株），其余4株分屬于Wickerhamomyces（2株），Pichia和Saccharomyces（各1株）。而且10個樣品中乙酸乙酯和乙酸含量的比例表現出了比表1更為紊亂的關系。

2.5 糟醅中乙酸乙酯含量與乙酸的關系

圖1 每株菌乙酸乙酯含量與對應的乙酸含量的關系Fig.1 Correlation between the content of acetic ester and acetic acid for each strain

圖1顯示了122株酵母對應的樣品中乙酸乙酯和乙酸含量（以乙酸乙酯含量由少到多排序）。圖1和表1、表2均顯示接種了酵母菌的糟醅中乙酸含量與乙酸乙酯含量沒有對應關系。而且窖內發酵糟醅中的乙酸乙酯僅為空白對照的2倍左右，但乙酸含量卻僅有空白對照的1.4%。這些都表明濃香型白酒窖內發酵過程中乙酸乙酯的生成途徑不僅僅是乙醇與乙酸酯化的結果，還存在其他途徑，這些途徑可能是窖內乙酸乙酯生成的主要途徑。這也與王治國等[12]的研究結果和目前化工工業中合成乙酸乙酯的有多個途徑[13]的現實狀況是吻合的。

3 討論

本研究中，盡管糟醅在三角瓶中發酵與在窖內發酵存在較大的差異，但縱觀本研究的所有結果，發酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的含量的比值表現出明顯的無序性，既在窖內發酵過程中乙酸可能不是乙酸乙酯生成的限制性條件，濃香型白酒中乙酸乙酯的生成可能存在多種途徑。但濃香型白酒釀造過程是一個及其復雜的微生物代謝過程，影響因素眾多，要探明發酵過程中乙酸和乙酸乙酯的關系尚需通過大量的實驗數據進一步驗證。

表1 糟醅中乙酸乙酯含量最高的10株酵母Table 1 10 strains produced most acetic ether in fermentation grain

表2 糟醅中乙酸含量最低的10株酵母Table 2 10 strains produced least acetic ether in fermentation grain

相對于窖內對照和空白對照中乙酸乙酯和乙酸的比值（分別為6.33和4.4×10-2），接種了酵母菌的發酵糟醅中乙酸乙酯和乙酸的比值關系變得極為混亂，最低僅為7.43×10-4，最高卻達到了9.03×103。這也在相當程度上顯示在濃香型白酒窖內發酵體系中強化接種很可能改變窖內發酵體系的均衡，存在較大的風險，需要在對微生物區系及代謝產物的充分認識的基礎上應用。

4 結論

所有接種了酵母的糟醅中乙酸和乙酸乙酯含量與空白對照均有較大差異，這表明這些酵母都能夠在添加了黃水的入窖糟醅（高酸度中）生長。這些顯示經過濃香型白酒（長期）生產所形成的高酸、高醇環境的選擇作用，生產環境中的酵母菌均能夠適應糟醅的理化環境，并影響發酵糟醅中的生物化學反應。

分離自釀造環境的酵母中，絕大多數酵母可以降低發酵糟醅中乙酸含量、提高乙酸乙酯的含量，而且還有相當部分酵母作用效果顯著。其中分離自曲房空氣的Z9Y-7-B（Debaryomyces sp.）可使糟醅中乙酸乙酯達到2.11g/L，而乙酸含量卻僅為2.3×10-4g/L。這些菌株具有通過強化制曲在濃香型和清香型白酒釀造、利用丟糟和黃水生產乙酸乙酯等方面應用的潛力。

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Correlation between yeast isolated from Luzhiu-flavour liquor brewing environment and the generating of acetic acid and ethyl acetate in fermentation

WANG Tao1，LI Jin-meng1，YOU Ling2，YUAN Hao1，FENG Xue-yu3，CAO Zi-jian3，*
（1.College of Life Science＆Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000，China；2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province，Yibin 644000，China；3.Chengdu Normal University，Chengdu 610041，China）

In order to explorer the correlation between yeasts and the generating of acetic acid or ethyl acetate in Luzhou-flavor Liquor fermentation，122 strains isolated from all stage of the fermentation were inoculated in special semisolid medium（prepared with fermentative grain and yellow water，without be sterilized）and fermented for 75 days，then acetic acid and ethyl acetate were detected，the medium not be inoculated and the fermentative grain in the pit were set as the blank control and the normal control respectively.The result showed that 84 strains could enhance the generating of ethyl acetate compared with the blank control and 54 strains stimulated its generating with a highest content of 3.74g/L accounting to 3.94 times the normal control. 120 strains could restrain the generating of acetic acid compared with the blank control，15 strains inhibit its generating，the content of acetic acid was only 2.03×10-4g/L accounting to 0.13%of the normal control，while no clear correspondence between 122 strains of yeast and the generating of acetic acid or ethyl acetate could be deduced based the above results.

Luzhou-flavor liquor；ethyl acetate；acetic acid；yeast

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0184-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.033

2013－08－19 *通訊聯系人

王濤（1973-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：微生物技術。

四川省科技廳支撐計劃項目（2010NZ0091，2013SZ0054）；國家固態釀造工程技術研究中心開放項目（GCKF201115）；四川省屬高校白酒生產技術創新團隊建設計劃資助項目；宜賓市科技專項研究項目（2010ZGY016，2011ZJY010）；2012年地方高校國家級大學生創新訓練計劃項目（201210641102）。