單曲霉菌與混合曲霉菌發(fā)酵對纖溶酶活性的影響

周媛媛，孫 楚，李永平，劉曉玲，李 秋，吳 非，*

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.東北農業(yè)大學經管學院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江糧食職業(yè)學院，黑龍江哈爾濱150030；4.黑龍江省質量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江哈爾濱150030）

單曲霉菌與混合曲霉菌發(fā)酵對纖溶酶活性的影響

周媛媛1，孫 楚2，李永平3，劉曉玲4，李 秋1，吳 非1，*

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.東北農業(yè)大學經管學院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江糧食職業(yè)學院，黑龍江哈爾濱150030；4.黑龍江省質量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江哈爾濱150030）

以三株經過篩選誘變得到的纖溶酶高產突變株作為實驗菌株，以大豆為原料，選取誘變后纖溶酶活性較大的黑曲霉3.4309進行單因素實驗，以纖溶酶活性為指標，確定其產纖溶酶活性的最適發(fā)酵溫度為30℃、接種量為10%、料水比0.6mL/g、裝料量20g/250mL、pH5.5，發(fā)酵72h纖溶酶活性達到1.16TAME U/mL。在此條件下，運用混料設計確定最適的混菌接入量為黑曲霉3.4309添加4.3%、米曲霉3.800添加2.1%、米曲霉3.5232添加3.6%，72h發(fā)酵纖溶酶活性最大達到1.311TAME U/mL，比最優(yōu)條件下單菌發(fā)酵纖溶酶活性高13%。

大豆，單霉菌發(fā)酵，混合霉菌發(fā)酵，纖溶酶活性

血栓病是涉及到血液和循環(huán)系統(tǒng)的一種疾病，嚴重危害人類健康，是對死亡威脅最大的疾病之一[1]。溶栓治療即利用纖溶酶水解纖維蛋白原和纖維蛋白，使非纖溶蛋白轉變?yōu)榭扇苄运槠倪^程，是治療血栓性疾病安全有效的手段[2]。目前，國內外已正式批準的臨床溶栓藥物有尿激酶、鏈激酶[3]等，但這些藥物盡管溶栓效果好，卻還存在許多缺點且不能口服。因此，尋找安全有效、無毒副作用[4-5]、服用方便的新型溶栓劑或溶栓保健食品具有重要意義。

具有溶栓作用的纖溶酶是一種蛋白酶，微生物以大豆為基質發(fā)酵能產生纖溶酶，是因為大豆中蛋白質含量高，結構復雜，導致其生長環(huán)境中存在和血纖維蛋白結構類似或一致的誘導物。國際上，對于傳統(tǒng)豆制品來源纖溶酶的發(fā)現(xiàn)最早開始于1987年日本學者從納豆中分離出了納豆激酶[6]，國內報道的產纖溶酶霉菌有根霉[7]、脈孢霉[8]和米曲霉[9]，本研究以大豆為原料，以經過篩選誘變的黑曲霉和米曲霉為實驗菌株，采用固態(tài)發(fā)酵法應用混料設計確定最適的混菌接入比例，并分別對單菌、混菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究進行比較。雖然目前對于微生物法產纖溶酶的研究較多，但是大多數(shù)都是通過單菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化提高酶活，而混菌發(fā)酵產纖溶酶的研究很少，本研究即是想通過尋找一種新的發(fā)酵方式，即混菌發(fā)酵來提高酶活，預實驗表明同時接種發(fā)酵，產酶活性較高。其結果可應用于食品加工，為新型溶栓保健食品的開發(fā)，及纖溶酶的提取純化以開發(fā)口服用藥提供基礎，也為大豆的綜合利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉3.4309、米曲霉3.800、米曲霉3.5232 均由東北農業(yè)大學實驗室提供，經紫外、微波誘變后纖溶酶活力分別為0.737、0.721、0.686TAME U/mL；大豆培養(yǎng)基 取大豆加水浸泡6～8h，瀝干后置于鍋內煮熟，將煮熟的大豆碾碎，為霉菌的發(fā)酵基質；對甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME） Sigma公司；變色酸、硫酸、甲醇等試劑 均為分析純。

高壓濕熱滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠；722可見光分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；振蕩培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司；超凈工作臺 北京安泰科技有限公司；pHS-25型pH計 上海精科雷磁儀器廠；JD500-2型分析天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；高速離心機 上海珂淮儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 霉菌菌株活化 選取誘變后纖溶酶活性最高的黑曲霉3.4309作為實驗菌株。從凍存管中取300μL菌液分別接入10mL PDA液體培養(yǎng)基中，30℃下活化培養(yǎng)72h，然后分別吸取1.5mL菌液于50mL PDA培養(yǎng)基中，30℃下活化培養(yǎng)60h，再分別吸取3mL菌液于100mL PDA培養(yǎng)基中，30℃下活化培養(yǎng)54h待用。

1.2.2 纖溶酶活性的測定 纖溶酶能夠特異地催化TAME的分解，用TAME底物法來測定纖溶酶的酶活性[10-11]。活性單位TAME U/mL是指每毫升發(fā)酵液催化TAME分解的單位數(shù)量，即每毫升發(fā)酵液的纖溶酶活性。

1.2.3 單霉菌發(fā)酵大豆產纖溶酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化 選取誘變處理后，纖溶酶活性最大的黑曲霉3.4309作為實驗菌株。通過單因素實驗，確定發(fā)酵溫度、料水比、菌種添加量、裝料量以及培養(yǎng)基初始pH對單霉菌發(fā)酵大豆產纖溶酶活性的影響。

1.2.3.1 發(fā)酵溫度對纖溶酶活性的影響 在菌種添加量為10%的條件下，用黑曲霉3.4309發(fā)酵大豆，設定發(fā)酵溫度分別為26、28、30、32、34℃，在此條件下發(fā)酵72h，比色法測發(fā)酵液的纖溶酶活性，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.3.2 料水比對纖溶酶活性的影響 在菌種添加量為10%、發(fā)酵溫度30℃的條件下，分別向培養(yǎng)基中按0.2、0.4、0.6、0.8、1mL/g的量加入水，用黑曲霉3.4309發(fā)酵72h，比色法測發(fā)酵液的纖溶酶活性，確定最佳料水比。

1.2.3.3 菌種添加量對纖溶酶活性的影響 以黑曲霉3.4309發(fā)酵大豆，在發(fā)酵溫度30℃，菌種的添加量分別為4%、6%、8%、10%、12%的條件下發(fā)酵72h，比色法測定發(fā)酵液中纖溶酶活性，確定最佳菌種添加量。

1.2.3.4 裝料量對纖溶酶活性的影響 分別向250mL三角瓶中加入15、20、25、30g培養(yǎng)基，30℃以黑曲霉3.4309添加量為10%發(fā)酵72h，比色法測定發(fā)酵液中纖溶酶活性，確定最佳裝料量。

1.2.3.5 培養(yǎng)基初始pH對纖溶酶活性的影響 調節(jié)培養(yǎng)基的初始pH分別為4、4.5、5、5.5、6、7。30℃以黑曲霉3.4309添加量為10%發(fā)酵72h，比色法測定發(fā)酵液中纖溶酶活性，確定培養(yǎng)基最佳初始pH。

1.2.4 混合霉菌發(fā)酵大豆產纖溶酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

根據(jù)以上實驗，以發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72h，菌種添加量10%為固定值，采用混料實驗設計[12-13]，混合霉菌發(fā)酵大豆，以A（黑曲霉3.4309添加量）、B（米曲霉3.800添加量）、C（米曲霉3.5232添加量）分別表示自變量，以纖溶酶活性為因變量，確定因素水平編碼表如表1所示。

實驗采用混料設計中的Simplex Centroid方法，應用Design-Expert軟件進行分析，編碼設置是系統(tǒng)自動生成的。實際生產中將百分比換算成L或g是可以達到的。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.2.5 驗證實驗 通過運用混料實驗設計研究混菌不同配比參數(shù)對纖溶酶活性的影響，得到產纖溶酶活性的最優(yōu)菌株配比值。考察最優(yōu)混合菌配比參數(shù)工藝條件下，進行3次驗證實驗取平均值。對比最優(yōu)混合菌配比條件下得到的驗證值與預測值之間的標準偏差是否在合理范圍內。

1.2.6 單霉菌與混合霉菌復合發(fā)酵對纖溶酶活性的影響 在分別確定單霉菌、混合霉菌最優(yōu)發(fā)酵條件的基礎上，分別在最優(yōu)條件下進行發(fā)酵，測定產酶曲線，對比纖溶酶活性差異。

1.2.7 統(tǒng)計分析 單因素實驗采用Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理，每組實驗均做3組檢測；混料設計采用Design Expert進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與討論

2.1 單霉菌發(fā)酵產纖溶酶條件的優(yōu)化結果

2.1.1 發(fā)酵溫度對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 由圖1可知，發(fā)酵溫度對纖溶酶活性影響的結果可知，溫度對纖溶酶活性的影響較大，當溫度在28～30℃時，纖溶酶活性隨著溫度的升高而逐漸增大，30℃時發(fā)酵液纖溶酶活性最高，為0.965TAME U/mL，隨后酶活逐漸降低，這與閔偉紅等的研究結論一致[14]。

圖1 溫度對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.1 The influence of temperature to fibrinolytic activity

2.1.2 料水比對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 由圖2可知，培養(yǎng)基的水分含量不同，纖溶酶活性大小也不相同。水分含量低時，霉菌菌絲生長不旺盛，產酶量低；水分含量高時，不利于通風，菌體生長不夠旺盛，也不利于產酶。當料水比為0.6mL/g時為最優(yōu)，此時纖溶酶活性達到0.864TAME U/mL。

圖2 料水比對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.2 The influence of water ratio to fibrinolytic activity

2.1.3 接種量對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 由圖3可知，隨著接種量的逐漸增加，菌群生長加快，大豆培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質得到充分利用，纖溶酶活性逐漸升高。當接入10%的菌液時，纖溶酶活性最大達到1.116TAME U/mL。接菌量繼續(xù)增加，菌體生長過快，培養(yǎng)基黏性大，溶氧不足，影響菌株代謝產酶，纖溶酶活性降低。

2.1.4 裝料量對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 圖4為裝料量對纖溶酶活性的影響，不同的裝料量通過影響菌株的通氣量，從而影響菌株的生長代謝。由圖4可知，裝料量為20g/250mL為宜，此時，纖溶酶活性最大為0.912TAME U/mL。

圖3 接種量對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.3 The influence of adding amount of strains to fibrinolytic activity

圖4 裝料量對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.4 The influence of loading capacity to fibrinolytic activity

2.1.5 培養(yǎng)基pH對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響 圖5為培養(yǎng)基初始pH對纖溶酶活性的影響，由圖5可知，在大豆培養(yǎng)基的自然pH范圍5～5.5范圍內纖溶酶活性較大，當pH為5.5時，纖溶酶活性最大達到0.806TAME U/mL。因此，pH5.5為該菌株生長和生產纖溶酶的最佳初始pH，這與楊雪佳等[15]的研究結論一致。

圖5 培養(yǎng)基pH對單菌發(fā)酵纖溶酶活性的影響Fig.5 The influence of pH to fibrinolytic activity

2.2 混合霉菌發(fā)酵大豆產纖溶酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 混合霉菌發(fā)酵大豆對纖溶酶活性的影響 以黑曲霉3.4309添加量A（%）、米曲霉3.800添加量B（%）和米曲霉3.5232添加量C（%）分別代表的因素為自變量，以纖溶酶活性R為因變量，實驗設計與數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計軟件Design-Expert來完成，實驗設計及結果見表2。

通過統(tǒng)計分析軟件Design-Expert進行數(shù)據(jù)分析，建立纖溶酶活性R回歸模型如下：纖溶酶活性R=1.09A+0.95B+1.08C-0.14AB+0.10AC-0.57BC+ 9.93ABC。采用Design-Expert軟件對纖溶酶活性R模型方程進行方差分析，結果見表3。

表2 實驗安排及結果Table 2 Experiment plan and results

單一項都顯著，表中只顯示了交互項的顯著性分析，未顯示單一項。由表3可知，該模型回歸顯著（p＜0.05），失擬項不顯著（p＞0.05），并且該模R2=92.20%，說明該模型能很好地擬合該實驗。通過F值和p值可知交互項之間的相互作用對纖溶酶活性R影響顯著性關系為：ABC＞BC＞AB＞AC，也就是說黑曲霉3.4309添加量、米曲霉3.800添加量和米曲霉3.5232添加量三種菌株之間的交互作用比其中任意兩種菌株之間的交互作用對纖溶酶活性的影響顯著，說明三種菌株的混合發(fā)酵對產品纖溶酶活性的影響較大。交互項對纖溶酶活性的等高線分析見圖6。

圖6 混料設計因素交互項對纖溶酶活性的等高線分析Fig.6 Contours analysis for mixture design factor interaction to fibrinolytic activity

由圖6可以看出，A、B、C交互作用對纖溶酶活性的影響。三種菌株以一定的比例混合時的纖溶酶活性大小優(yōu)于任意兩種菌株混合的纖溶酶活性值，只有當三種菌株以一定的比例混合時，纖溶酶活性有較大值，這與方差分析的結果一致。

圖7 混菌比例對纖溶酶活性的混料設計優(yōu)化結果Fig.7 Mixing design optimization results of ratio of three moulds to fibrinolytic activity

圖7為霉菌菌株混合發(fā)酵對纖溶酶活性的混料設計優(yōu)化結果。由圖7可知，黑曲霉3.4309、米曲霉3.800和米曲霉3.5232添加量分別為4.3%、2.1%和3.6%時，纖溶酶活性有最大值為1.343TAME U/mL。因此，當黑曲霉3.4309、米曲霉3.800和米曲霉3.5232分別接種4.3%、2.1%和3.6%時，發(fā)酵液的纖溶酶活性較高。

2.2.2 驗證實驗 為了驗證模型預測的準確性，在最優(yōu)混菌培養(yǎng)條件下，即黑曲霉3.4309、米曲霉3.800、米曲霉3.5232添加量分別為4.3%、2.1%、3.6%，重復進行3次平行實驗，3次平行實驗纖溶酶活性的平均值為1.320與預測值1.343較接近。說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好。最終確定最適產纖溶酶的混合菌株添加量分別為：黑曲素3.4309添加4.3%、米曲霉3.800添加2.1%、米曲霉3.5232添加3.6%。

表3 回歸方程的方差分析結果Table 3 Regression equation of the results of variance analysis

2.3 單霉菌與混合霉菌復合發(fā)酵對纖溶酶活性的影響

根據(jù)以上實驗結果，分別在最優(yōu)產纖溶酶條件下分別進行單菌、混菌發(fā)酵，測定發(fā)酵液的纖溶酶活性。結果如圖8所示。

圖8 對比不同發(fā)酵方式在最優(yōu)條件下的產纖溶酶曲線Fig.8 Comparing the influence of different fermention to plasmin curve under optimal conditons

由圖8看出，由三種霉菌混合發(fā)酵與單霉菌發(fā)酵相比，纖溶酶活性有顯著提高。分析可能是由于不同微生物發(fā)酵產生的纖溶酶分子量大小、結構、酶切位點均有差別，故三種霉菌混合發(fā)酵可以彌補相互間產酶的差異，產生多種不同的纖溶酶，充分發(fā)揮各酶間的協(xié)同作用，大幅度提高酶活性及產量。因此，混菌發(fā)酵比單菌發(fā)酵酶活性及產量要高。由圖8可知，發(fā)酵24h，霉菌處于遲緩期，兩種發(fā)酵方式產生的纖溶酶均較少，隨著時間延長，菌株進入對數(shù)期和穩(wěn)定期，此階段酶活力顯著提高而穩(wěn)定，代謝旺盛。發(fā)酵至72h，兩種發(fā)酵方式產纖溶酶活性分別達到最大，混菌發(fā)酵產纖溶酶活性為1.311TAME U/mL，單菌發(fā)酵產纖溶酶活性為1.16TAME U/mL，混菌發(fā)酵較單菌發(fā)酵方式產纖溶酶活性高13%。由此可知，混合霉菌發(fā)酵產纖溶酶優(yōu)于單菌株發(fā)酵。

3 結論

由單霉菌發(fā)酵大豆產纖溶酶的優(yōu)化結果可知：在接種量為10%、發(fā)酵溫度為30℃、料水比為0.6mL/g，裝料量為20g/250mL，培養(yǎng)基初始pH5.5時，纖溶酶活性最大，發(fā)酵72h達到1.16TAME U/mL；在相同條件下，利用混料設計優(yōu)化得到的最適混合霉菌培養(yǎng)接菌量即黑曲霉3.4309添加4.3%、米曲霉3.800添加2.1%、米曲霉3.5232添加3.6%時，發(fā)酵72h，最終發(fā)酵液纖溶酶活性達到1.311TAME U/mL，高于任何一種單霉菌發(fā)酵時的纖溶酶活性。即混合霉菌發(fā)酵大豆時纖溶酶活性得到了提高，此種發(fā)酵方式的發(fā)現(xiàn)為進一步纖溶酶的提取及高纖溶活性食品的開發(fā)提供了基礎。

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Effect of single and mixed moulds fermentation methods on fibrinolytic activity

ZHOU Yuan-yuan1，SUN Chu2，LI Yong-ping3，LIU Xiao-ling4，LI Qiu1，WU Fei1，*
（1.Institute of Food，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Institute of economic management，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；3.Heilongjiang Grain Vocational College，Harbin 150030，China；4.Institute of Quality supervision and Inspection，Heilongjiang province，Harbin 150030，China）

Three screened and mutagenesised species of moulds was selected as trial strains，and were cultured in soybeans.Aspergillus niger 3.4309 was used to do single factor test for its higher fibrinolytic activity，using fibrinolytic activity as index，determine its optimum fermentation temperature was 30℃，inoculation amount was 10%，the ratio of water was 0.6mL/g，loading capacity was 20g/250mL，the optimum pH was 5.5.Under these optimum conditons，the fibrinolytic activity could reach 1.16 TAME U/mL.Then used the mixture design method to determin the optimum mixed inoculation amount was：Aspergillus niger 3.4309 4.3%added，Aspergillus oryzae 3.800 2.1%added and Aspergillus oryzae 3.6%added.In this way，the fibrinolytic activity could reach 1.311 TAME U/mL，13%higher than fibrinolytic activity of single mould fermentation.

soybean；single moulds fermentation；mixed moulds fermentation；fibrinolytic activity

TS201.1

A

1002-0306（2014）08-0161-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.028

2013－08－19 *通訊聯(lián)系人

周媛媛（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：糧食、油脂與植物蛋白工程。

黑龍江省應用技術研究與開發(fā)計劃項目（GC13B213）。