蛹蟲草子實體多糖對腹水型肝癌移植瘤超微結(jié)構(gòu)的影響

郭麗新，馮 哲，齊 彥，魏博洋，王世龍，趙 敏

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010）

蛹蟲草子實體多糖對腹水型肝癌移植瘤超微結(jié)構(gòu)的影響

郭麗新1，2，馮 哲3，齊 彥2，魏博洋2，王世龍2，趙 敏1，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010）

目的：研究蛹蟲草多糖（CMPS）對小鼠移植型腹水型肝癌（H22）體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作用，探討其抑瘤作用機制。方法：建立H22移植瘤小鼠模型，采用電鏡技術(shù)觀察H22荷瘤小鼠腫瘤組織的超微結(jié)構(gòu)改變；免疫組織化學(xué)法檢測蛹蟲草多糖作用后H22腫瘤組織細胞內(nèi)P53蛋白的表達情況。結(jié)果：電鏡觀察到蛹蟲草多糖作用后H22腫瘤組織細胞有早期凋亡改變，腫瘤組織內(nèi)有凋亡細胞存在；免疫組化實驗結(jié)果顯示，蛹蟲草多糖作用后H22小鼠腫瘤組織細胞突變型P53蛋白的表達水平降低。結(jié)論：蛹蟲草多糖具有誘導(dǎo)小鼠H22肝癌細胞凋亡作用，促凋亡作用可能與其降低H22小鼠腫瘤組織細胞內(nèi)突變型P53蛋白的表達有關(guān)。

蛹蟲草多糖，超微結(jié)構(gòu)，H22，P53，細胞凋亡

蛹蟲草（Cordyceps militaris（Fr）Link）為藥用蟲草之一，Vaillan于1723年在《BotaniconParisiense》一書中描述了蛹蟲草的自然形態(tài)、生活習(xí)性，基源鑒定，1772年在法國巴黎科學(xué)院院士年會上，被正式命名為蛹蟲草，定為蟲草屬的模式種，其藥效成分主要是蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖等。蛹蟲草具有抗疲勞、提高機體免疫力和抗癌等作用。隨著以蟲草為原料的醫(yī)藥保健產(chǎn)品的不斷深入開發(fā)，20世紀50年代以來，國內(nèi)對蛹蟲草的人工栽培技術(shù)進行了攻關(guān)式的研究，到80年代中期實現(xiàn)了其人工栽培，我國成為世界上大批量培養(yǎng)蛹蟲草子實體的國家。

對蛹蟲草的現(xiàn)代研究表明，可提高果蠅種群的壽命，具有抗衰老作用[2]；可增加脾臟和胸腺的重量，對抗可的松及環(huán)磷酰胺引起的脾臟萎縮及白細胞下降，活化T淋巴細胞、B淋巴細胞，增加抗體IgG、IgM的含量等，是很好的免疫促進劑；具有抗突變作用[3]，在抗腫瘤方面，蛹蟲草水提物可抑制體外培養(yǎng)的BGC-823胃癌細胞、U937白血病細胞及SMMC-7721肝癌細胞生長，并誘導(dǎo)其細胞凋亡、蛹蟲草提取物（主要成分蟲草素）可降低端粒酶活性，對人結(jié)腸癌細胞SW111C生長有抑制作用[4-6]。目前對于蛹蟲草多糖的研究多見于提取工藝、含量測定、分子結(jié)構(gòu)、抗氧化、免疫作用等的研究，缺乏體內(nèi)誘導(dǎo)凋亡、抗腫瘤作用的研究。細胞凋亡與腫瘤發(fā)生的關(guān)系是近年來研究的一個熱點。從癌的治療上考慮，誘導(dǎo)癌細胞的凋亡能使癌縮小或消失，故研究誘導(dǎo)癌細胞的凋亡對癌癥的治療有重要的意義。細胞凋亡已經(jīng)成為評估療效的一項新指標，進一步提高腫瘤細胞凋亡與增殖的比值是臨床化療的新要求。本課題通過制備H22移植瘤小鼠模型，探討人工培養(yǎng)蛹蟲草提取物——蛹蟲草多糖體內(nèi)誘導(dǎo)H22腫瘤細胞凋亡作用，旨在為抗腫瘤作用研究及蛹蟲草的進一步開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級小白鼠，雄性，體重（20±2）g 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心；H22腫瘤細胞株 黑龍江省腫瘤研究所；蛹蟲草 東北林業(yè)大學(xué)微生物教研室提供；蛹蟲草多糖（CMPS）注射液 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室；環(huán)磷酰胺、多聚甲醛 Sigma；0.1mol/L枸櫞酸緩沖液、蘇木素染色液、中性樹膠、P53抗體、SP免疫組化檢測試劑盒 北京中山生物工程公司產(chǎn)品；丙酮等 分析純。

T12D326透射電子顯微鏡 荷蘭飛利浦；AB204-N電子分析天平 瑞士METTLER；S.HH.W21-600三用電熱恒溫水浴箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；LDZ4-0.8離心機 北京醫(yī)用離心機廠；多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng) 同濟醫(yī)科大學(xué)清平影像工程公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 荷瘤小鼠模型制備 選擇7～9d生長良好的瘤株，無菌取腹水，腹水為乳白色無絮狀沉淀物者為佳，將腹水置于50mL離心管中，加入10mL 0.9%生理鹽水，1000r/min離心5min，棄上清液。用0.9%生理鹽水復(fù)懸，0.2%臺盼藍染色，計活細胞數(shù)大于95%，用生理鹽水稀釋至2×106個/mL，以0.1mL/只接種于常規(guī)皮膚消毒后的小鼠右前肢腋窩皮下。將接種后的小鼠隨機分成5組：CMPS1組（25mg/kg）、CMPS2組（50mg/kg）、CMPS3組（100mg/kg）組、環(huán)磷酰胺（CTX）組、鹽水組，每組15只，正常飼養(yǎng)。接種6h后，各組肌肉注射給藥0.08mL/只，每日1次，連續(xù)給藥12d，觀察動物腫瘤生長情況，直至陰性對照組腫瘤達到1g以上，于末次給藥24h后利用頸部脫臼方法處死小鼠，仰臥位固定，胸部用75%的酒精消毒，在右前肢腋窩剝離瘤體，然后用冷生理鹽水洗滌，用濾紙吸干。

1.2.2 H22腫瘤組織電鏡實驗 切取各組腫瘤組織，分別放入平皿中，放入少量的固定液，切取2mm3大小的組織塊，用3%戊二醛進行前固定，磷酸沖洗液沖洗，鋨酸后固定，蒸餾水沖洗，丙酮梯度脫水（50%、70%、90%、100%），浸透24h，聚合24h，包埋劑812#包埋，半薄切片，超薄切片，電子染色，電鏡下觀察腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 免疫組化法檢測腫瘤組織p53蛋白表達 取鹽水組和CMPS1組、CMPS2組、CMPS3組瘤組織，常規(guī)固定、石蠟包埋，5μm切片。石蠟切片后常規(guī)脫蠟至水，浸入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10min后蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，用0.lmol/L枸櫞酸緩沖液抗原微波修復(fù)。滴加正常山羊血清封閉，室溫15min，傾去，加1∶50稀釋的P53抗體4℃孵育過夜，PBS沖洗，3min×3次。洗后加生物素標記的二抗，37℃孵育15min。再用PBS沖洗后，加辣根酶標記鏈酶卵白素，PBS沖洗，滴加DAB染色、蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、中性樹膠封片。空白對照用PBS取代一抗，陽性對照為已知陽性片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

顯微攝影，運用多媒體彩色病理圖象分析系統(tǒng)分析。用SPSS 11.0軟件包中的方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CMPS對H22腫瘤組織細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡結(jié)果顯示鹽水組細胞呈多邊形或菱形，核圓，核仁清晰，胞漿內(nèi)可見豐富的細胞器結(jié)構(gòu)（圖1A）；CMPS1組大部分細胞微絨毛脫失，并可見崩解壞死的細胞碎片，大部分細胞核異染色質(zhì)邊集且凝集（圖1B）；CMPS2組可見大量凋亡壞死細胞或凋亡崩解細胞（圖1C）；CMPS3組部分細胞核碎裂，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡狀結(jié)構(gòu)，核呈凋亡樣結(jié)構(gòu)（圖1D）；CTX組部分細胞崩解壞死，并可見部分細胞核異染色質(zhì)邊集，細胞器模糊不清（圖1E）。

圖1 H22腫瘤組織細胞超微結(jié)構(gòu)（2550×）Fig.1 Ultrastructure of tumor cell（2550×）

細胞凋亡是細胞由基因控制的自主過程，表現(xiàn)為細胞縮小，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，核質(zhì)邊緣化，膜發(fā)泡，凋亡小體形成等，而細胞壞死是非自主過程，其細胞膜喪失完整性和化學(xué)梯度，細胞質(zhì)內(nèi)容物外泄引起細胞溶解死亡[7]。細胞凋亡的定性檢測依賴于形態(tài)學(xué)觀察，本研究電鏡結(jié)果顯示CMPS1組表現(xiàn)出細胞凋亡的初期表現(xiàn)，CMPS2、CMPS3組出現(xiàn)明顯的凋亡結(jié)構(gòu)特征，CMPS各組超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的凋亡改變，提示CMPS具有促進H22肝癌細胞凋亡作用。細胞凋亡對機體的正常發(fā)育、生長，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持等具有重要的作用。在各種致癌因素作用下，組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，可導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成腫瘤。合理利用凋亡因素，干預(yù)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因，控制凋亡相關(guān)酶的活性等，對腫瘤可起到治療作用。蛹蟲草多糖具有促進H22肝癌細胞凋亡作用，顯示其在抗腫瘤方面可發(fā)揮作用。

2.2 CMPS對H22腫瘤組織細胞p53蛋白表達的影響

SP免疫組化染色后，P53陽性染色為位于細胞核的棕黃色顆粒[8]，經(jīng)多媒體彩色病理圖象分析系統(tǒng)分析表達情況。通過對面積、等效直徑、形狀因子、異形指數(shù)、平均光度分析，以陽性單位相對數(shù)值進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1。

表1 CMPS對瘤組織p53蛋白表達的影響（±s）Table 1 The influence of CMPS on the expression of p53（±s）

表1 CMPS對瘤組織p53蛋白表達的影響（±s）Table 1 The influence of CMPS on the expression of p53（±s）

注：*與鹽水組比較p<0.05。

組別 p53蛋白相對表達量鹽水組 40.01±3.88 CMPS1 34.57±3.50* CMPS2 33.23±3.08* CMPS3 33.90±3.46*

表1實驗結(jié)果表明：蛹蟲草多糖各組與陰性對照組比較，對H22腫瘤組織細胞突變型p53蛋白表達有明顯的下調(diào)作用（p＜0.05）。

p53基因是一種細胞凋亡相關(guān)的抑癌基因，位于細胞核內(nèi)，是一種由393氨基酸組成的含磷蛋白，分子量為53ku。p53基因分為野生型和突變型兩種[9]。野生型p53有“分子警察”的作用，監(jiān)視細胞基因的完整性，能通過凋亡誘導(dǎo)細胞自殺，阻止具有癌變傾向的突變基因的細胞產(chǎn)生，從而起到抑癌作用。當(dāng)p53基因突變后，喪失了監(jiān)視細胞周期和啟動細胞凋亡程序的能力，而使細胞增殖失控，與許多腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。正常細胞中野生型p53所表達的蛋白由于半衰期極短，通常免疫組化的方法檢測不出來；而突變型p53基因為致癌基因，它所表達的蛋白由于半衰期較長，可通過免疫組化方法檢測到[7]。本實驗采用免疫組化法檢測了H22腫瘤組織中p53蛋白表達情況，結(jié)果顯示，蛹蟲草多糖低、中、高劑量組對H22腫瘤組織細胞突變型p53蛋白表達有明顯的下調(diào)作用（p＜0.05）。

上述研究結(jié)果表明，蛹蟲草多糖可誘導(dǎo)H22腫瘤組織細胞凋亡，可能與凋亡相關(guān)基因腫瘤組織突變型p53的表達降低有關(guān)，進一步的作用機制有待探討。結(jié)合蛹蟲草多糖具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等的生物活性，提示其對機體的作用是多方面的，多方面協(xié)同可能更有利于調(diào)節(jié)機體的內(nèi)在平衡，有益于腫瘤的防治。

3 結(jié)論

實驗將蛹蟲草多糖體內(nèi)應(yīng)用于H22荷瘤小鼠，使H22移植瘤細胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的凋亡樣改變，并使腫瘤組織突變型p53蛋白表達降低，提示蛹蟲草多糖可誘導(dǎo)H22小鼠移植型腹水型肝癌細胞凋亡，具有抗腫瘤作用。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡機制可能與其降低凋亡相關(guān)基因突變型p53的表達有關(guān)。

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Effect of Cordyceps militaris polysaccharide on ultrastructure of tumor transplanted with hepatoma cells

GUO Li-xin1，2，F(xiàn)ENG Zhe3，QI Yan2，WEI Bo-yang2，WANG Shi-long2，ZHAO Min1，*
（1.Department of Microbiology，College of Life Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Department of Biochemistry，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；3.College of life Science and Technology，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

Objective：To evaluate the effects of Cordyceps militaris polysaccharides（CMPS）on apoptosis of tumor transplanted with hepatoma cells in mice（H22）in vivo and explore the anti-tumor mechanism.Methods：Establish H22 xenograft mouse model，electron microscope was used mehod to observe the ultrastructural changes of H22 in tumor bearing mice.P53 protein expression in H22 tumor cells was detected by immunohistochemistry method.Results：CMPS could reduce apoptosis in H22 hepatoma cells in mice.Conclusion：The apoptosis may be related to its decreasing mutant P53 protein expression in tumor tissue in mice.

Cordyceps militaris polysaccharide；ultrastructure；H22；P53；apoptosis

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0139-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.022

2013－11－25 *通訊聯(lián)系人

郭麗新（1967-），女，博士，副教授，研究方向：微生物制藥。