直接競爭ELISA法快速測定水產品中6種氟喹諾酮類藥物

王 強，王旭峰，楊金蘭，陳培基，楊宏亮，黎智廣，李劉冬

（中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（廣州），廣東廣州510300）

直接競爭ELISA法快速測定水產品中6種氟喹諾酮類藥物

王 強，王旭峰，楊金蘭，陳培基，楊宏亮，黎智廣，李劉冬*

（中國水產科學研究院南海水產研究所，農業部水產品加工重點實驗室，農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（廣州），廣東廣州510300）

采用過碘酸鈉法將抗環丙沙星單克隆抗體（MAb-CIP）與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯制備酶標抗體MAb-CIP-HRP，建立了檢測水產品中6種氟喹諾酮類藥物殘留的直接競爭酶聯免疫吸附分析方法（dcELISA），考察了包被原濃度、競爭反應時間和有機溶劑等因素對方法靈敏度的影響。結果表明：在優化的反應條件下，所建立的dcELISA針對環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和雙氟沙星6種氟喹諾酮類藥物的檢測限（LOD）均不超過0.5ng/mL，線性范圍（IC20～IC80）在1.0～12.1ng/mL之間；對蝦、鰻鱺和鯽魚三種水產樣品中添加5.0、10.0和20μg/kg時，加標回收率為70.4%～104.1%，相對標準偏差為5.0%～14.7%；本方法可用于水產品中氟喹諾酮類（FQs）藥物多殘留的快速測定。

氟喹諾酮，抗體，直接競爭ELISA，水產品

氟喹諾酮類抗生素（Fluoroquinolones，FQs）是在萘啶酸結構上7位引入哌嗪環，6位引入氟原子后得到的衍生物，屬于第三代喹諾酮類抗菌藥物[1]。該類藥物可治療和預防細菌感染，具有高效、低毒、組織穿透力強、抗菌譜廣和價格低廉等優點[2-3]。近年來，FQs類藥物被廣泛應用于畜牧和水產養殖行業，由此造成的藥物殘留問題日益突出。研究表明，動物性食品中殘留低濃度的FQs類藥物容易誘導致病菌對其耐藥性增強，并具有潛在致畸、致癌、致突變作用[4]。為了加強對FQs類藥物殘留的監控管理，我國及其他多個國家地區和組織對其最高殘留限量進行了限定[1，5]。

目前檢測動物源性食品中FQs類藥物的殘留方法主要有高效液相色譜—熒光檢測法（HPLC-FLD）[6]，液質聯用法（LC-MS/MS）[7]，高效毛細管電泳法（HPCE）[8]等以色譜分離為基礎的儀器方法，其分析結果準確可靠，適用于藥殘檢測結果的定量分析，但存在操作復雜、前處理繁瑣和設備昂貴等問題，限制了其廣泛應用于大批量樣本的快速分析。近年來，基于抗原抗體反應的多殘留酶免疫吸附分析方法（ELISA）以其廣譜特異性、快速、靈敏等優點，成為獸藥抗生素殘留快速篩查的研究熱點[9-10]。Wang等[1]建立了間接競爭ELISA檢測動物源性食品中6種FQs類藥物殘留，平均回收率為60.0%～93.0%。Emmanuella Uwamahoro[11]和楊正濤等[12]分別建立了檢測11種和4種FQs類藥物的多殘留間接競爭ELISA，但其僅用于標準品的測試，均未應用于實際樣品檢測。目前關于FQs類藥物多殘留直接競爭ELISA的研究甚少，因此本研究旨在通過制備酶標抗體，優化反應條件，建立了檢測水產品中6種FQs類藥物多殘留的直接競爭ELISA，進一步豐富多殘留免疫分析法的實際應用，為保障我國水產品質量安全提供一種有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、雙氟沙星、氧氟沙星、孔雀石綠標準品（純度≥98.0%）和辣根過氧化物酶（HRP） 美國Sigma公司；培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹、氯霉素標準品（純度≥95.5%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；抗環丙沙星單克隆抗體MAb-CIP、包被原CIP-OVA 本實驗室制備；包被液、PBS緩沖液、封閉液、TMB底物液、底物緩沖液等ELISA所需試劑 均按文獻[13]方法配制；辛酸、硫酸銨、過碘酸鈉（分析純） 廣州化學試劑廠；魚蝦類樣品 購于廣州市內農貿市場；實驗用水 18.2mΩ·cm超純水；其他試劑 均為分析純。

VersaMax酶標儀、MultiWashⅢ洗板機 美國Molecular Devices公司；API3000三重四級桿液質聯用儀 美國應用生物系統公司；R210型旋轉蒸發儀 瑞士BUCHI公司；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶標抗體的制備 采用過碘酸鈉法[14]，將辣根過氧化物酶（HRP）與經過辛酸—硫酸銨法純化的抗環丙沙星單克隆抗體（MAb-CIP）偶聯，制備酶標抗體MAb-CIP-HRP。

1.2.2 dcELISA檢測步驟

1.2.2.1 包被 用包被液將包被原CIP-OVA，稀釋至合適濃度，每孔100μL添加到酶標板孔中，4℃放置過夜。

1.2.2.2 封閉 用洗滌液洗滌2次，甩干后每孔加入封閉液120μL，37℃溫箱中封閉3h，甩干孔中液體后置于37℃烘箱中烘干備用。

1.2.2.3 加樣 用PBS緩沖液將藥物標準品稀釋成系列濃度，將酶標抗體MAb-CIP-HRP稀釋3000倍，每孔加入藥物標準液（或待測樣品）和酶標抗體各50μL，輕搖混合，37℃溫箱中孵育反應40min后洗滌液洗滌5次，甩干。

1.2.2.4 顯色與測定 將TMB底物液與底物緩沖液體積比1∶1混合后，每孔100μL添加到板孔中，37℃溫箱中顯色10min后每孔加入50μL終止液終止顯色反應，酶標儀測定其在450nm處的吸光度（A450nm）。

1.2.2.5 數據分析 以藥物標準液濃度的對數值為橫坐標，以B/B0（B為添加藥物時的吸光值，B0為不添加藥物時的吸光值）為縱坐標，使用Origin Pro 7.5軟件四參數對數函數進行曲線擬合，繪制對應的競爭標準曲線，計算獲得dcELISA的最低檢測限（LOD，IC10），半抑制濃度（IC50）、線性檢測范圍（IC20～IC80）等參數[13]。

1.2.3 方法特異性的評價 在最優的反應條件下，繪制不同藥物的競爭標準曲線，以交叉反應率（CR）評價方法的特異性，結果按式（1）計算：

1.2.4 樣品提取與凈化 魚類樣品去鱗、去皮，沿背脊取肌肉；蝦去頭、去殼，取肌肉部分。樣品均質處理成肉糜狀的待測試樣。準確稱取試樣5.0g，置于50mL聚苯乙烯離心管中，加入20mL酸化乙腈（含1%的乙酸），均質處理1min，漩渦混合2min，超聲波提取5min，以4000r/min離心5min，上清液轉移至蒸發瓶中。殘渣中加入15mL酸化乙腈，重復提取一次后合并兩次提取液，于45℃下減壓蒸干溶劑。用2mL PBS緩沖液和5mL正己烷充分復溶，漩渦混合2min后，棄去上層正己烷，用5mL正己烷重復上述操作一次。移取下層液體并用PBS緩沖液定容至10mL比色管中，取50μL直接用于dcELISA檢測。

2 結果與分析

2.1 酶標抗體工作濃度的選擇

本研究采用過碘酸鈉法將HRP表面的糖基氧化成醛基后與單抗MAb-CIP上的氨基進行偶聯，制備酶標抗體Mab-CIP-HRP。采用直接ELISA法來確定Mab-CIP-HRP的工作濃度，將包被原CIP-OVA包被到酶標板上，加入酶標抗體孵育反應，洗滌后加入顯色液，酶催化的顯色液吸光度值與酶標抗體含量呈正比[14]。結果顯示，在包被濃度為0.2μg/mL，Mab-CIP-HRP稀釋度在1/3000時，A450nm在1.4左右，可以滿足免疫分析法的檢測要求。因此，本研究選擇酶標抗體工作濃度為1/3000。

2.2 包被原濃度和競爭反應時間的確定

包被原濃度和競爭反應時間對ELISA的靈敏度有顯著影響，本研究通過單因素實驗對其進行優化，繪制不同反應條件下環丙沙星的競爭標準曲線，以Amax/IC50為參考標準評價曲線性能，其中Amax為對應曲線的最大吸光值，比值越大則代表靈敏度越高，重復性越好[15]。由圖1（a）所示，隨著包被原濃度的增加Amax逐漸增加，在最大包被濃度時IC50顯著升高，說明包被濃度過高時與酶標抗體親和力強，不利于游離的小分子藥物競爭反應，降低檢測靈敏度。在包被原濃度為0.2μg/mL時曲線的Amax/IC50最大，因此選擇包被原濃度為0.2μg/mL。同理，由圖1（b）所示，隨著反應時間的增加，Amax趨于平衡，IC50變化不大，反應時間為40min時曲線的Amax/IC50最大，因此選擇40min為dcELISA競爭反應時間。

圖1 包被原濃度和競爭反應時間對dcELISA的影響Fig.1 Influence of coating concentration and competitive time on dcELISA

2.3 有機溶劑甲醇和乙腈對反應的影響

有機溶劑會干擾免疫分析中抗原抗體的結合[16]，因此本研究選用兩種實驗中常用的水溶性有機溶劑甲醇和乙腈，考察其在緩沖體系中的含量對所建立的dcELISA靈敏度的影響。結果如圖2所示，當緩沖液中甲醇含量低于5%時，對dcELISA的靈敏度沒有顯著的影響，進一步甲醇含量增加至10%時，曲線Amax和IC50均有小幅度的升高。而隨著緩沖液乙腈含量的增加，曲線Amax不斷下降，IC50不斷升高，靈敏度顯著降低。因此，所建立的dcELISA的緩沖體系中可以耐受5%的甲醇含量，但乙腈含量則需嚴格控制。

2.4 方法特異性分析

基于前述最優的實驗條件參數，進行標準曲線的繪制。圖3是經Origin Pro 7.5軟件四參數對數函數擬合后環丙沙星的dcELISA標準曲線，擬合度良好并呈典型的S型曲線，IC50為2.1ng/mL。同時，為考察dcELISA的方法特異性，交叉反應研究使用了8種結構相似的FQs類藥物和2種水產品養殖過程中常見的抗菌類藥物（氯霉素和孔雀石綠）。結果如表1所示，dcELISA針對環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和雙氟沙星的交叉反應率均超過了65%，表明本方法具有寬譜特異性。結果同時顯示dcELISA針對上述6種高交叉反應的FQs類藥物的LOD均不超過0.5ng/mL，線性范圍（IC20～IC80）在1.0～ 12.1ng/mL之間，滿足國標GB/T 20366-2006和農業部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》的相關檢測要求，可用于這6種FQs類藥物殘留檢測。

圖2 甲醇和乙腈含量對dcELISA的影響Fig.2 Influence of concentration of methanol and acetonitrile on dcELISA

圖3 環丙沙星dcELISA標準曲線（n=3）Fig.3 Standard curve of dcELISA for ciprofloxacin（n=3）

表1 dcELISA的靈敏度和交叉反應率Table 1 Sensitivity and cross-reactivity for dcELISA

2.5 樣品添加回收測定

選擇對蝦、鰻鱺和鯽魚三種水產品進行樣品添加回收實驗。向樣品中分別添加5.0、10.0和20μg/kg三個水平的FQs類藥物標準液，室溫下放置過夜后用1.2.4方法處理，計算各水平的回收率和相對標準偏差（RSD）。結果如表2所示，dcELISA檢測6種FQs類藥物在三種水產樣品的加標回收率為70.4%～104.1%，RSD為5.0%～14.7%，表明本方法準確度和靈敏度良好，滿足水產樣品中6種FQs類藥物殘留痕量檢測的要求。

2.6HPLC-MS/MS比對檢測

隨機從農貿市場抽取魚蝦類水產樣品，將樣品平均分成兩組，一組按照1.2.3方法處理后用于dcELISA檢測（結果以環丙沙星含量來表示），另一組用HPLCMS/MS進行檢測，樣品處理方法和儀器參數設置參照GB/T 20366-2006，其中HPLC-MS/MS采用多反應監測（MRM）模式。圖4是6種FQs類藥物混合標準溶液的MRM離子流色譜圖（10ng/mL）。比對檢測結果顯示，隨機抽取了15份水產樣品，其中dcELISA和HPLC-MS/MS針對一份鯽魚樣品檢測出環丙沙星含量分別為8.3μg/kg和7.6μg/kg，其余14份樣品檢測結果均為陰性，表明兩種方法結果相關度高，結果準確可靠。

圖4 6種氟喹諾酮類藥物的MRM離子流色譜圖（10ng/mL）Fig.4 Multiple reaction monitoring chromatogram of six fluoroquinolones（10ng/mL）

3 結論

針對具有廣譜性抗菌作用氟喹諾酮類藥物的殘留監測，快速準確的多殘留免疫分析法是一種有效的篩選手段。通過免疫分析法對樣品進行初步篩查，進一步通過色譜儀器分析法對陽性樣品含量進行確證分析，有效提高了檢測工作的效率和準確度，近年來已逐步成為農獸藥殘留檢測的主要研究方向。本研究建立了檢測水產品中6種FQs類藥物殘留的dcELISA方法，方法靈敏度高，滿足相關限量標準的檢測要求，在三種水產品中的加標回收率為70.4%～104.1%，相對標準偏差為5.0%～14.7%，與HPLC-MS/ MS具有良好的相關性，結果準確可靠，可用于水產品中氟喹諾酮類藥物多殘留的快速測定。

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表2 水產品中6種氟喹諾酮類藥物的添加回收率（n=3）Table 2 Recovery of six fluoroquinolones from spiked aquatic product（n=3）

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Rapid determination of six fluoroquinolones in aquatic product by direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay

WANG Qiang，WANG Xu-feng，YANG Jin-lan，CHEN Pei-ji，YANG Hong-liang，LI Zhi-guang，LI Liu-dong*
（South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences；Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Minisitry of Agriculture；Laboratory of Quality and Safety Risky Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation（Guangzhou），Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China）

In this study，a direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay（dcELISA）was developed for rapid determination six fluoroquinolones in aquatic product.Horseradish peroxidase-labelled ciprofloxacin monoclonal antibody（MAb-CIP-HRP）was synthesized by NaIO4method.The effect of coating antigen concentration，competitive reaction time and organic solvents on the sensitivity of dcELISA were investigated. Under the optimized assay conditions，the dcELISA showed the limit of detection below 0.5ng/mL for ciprofloxacin，enrofloxacin，norfloxacin，pefloxacin，sarafloxacin and difloxacin，and the linear range（IC20～IC80）of 1.0 to 12.1ng/mL. Recoveries from spiked shrimp，eel and crucian at levels of 5.0，10 and 20μg/kg were in the range of 70.4%～104.1%，with relative standard deviation ranging from 5.0%to 14.7%.Results indicated that the established dcELISA was suitable for multi-analytes rapid determination of fluoroquinolones residues in aquatic product.

fluoroquinolone；antibody；direct competitive ELISA；aquatic product

TS207.3

A

1002-0306（2014）06-0061-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.004

2013－08－19 *通訊聯系人

王強（1988-），男，研究實習員，研究方向：漁業環境及水產品質量與安全。

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（2013TS08）；農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（廣州）暨廣東省食品質量安全重點實驗室開放課題基金（KLFQS201202）。