5-氮雜-2'-脫氧胞苷對人胃癌細胞株BGC803生長及死亡相關蛋白激酶基因表達的影響

沈薇 胡金瑤 高偉 趙慧

沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧沈陽110034

5-氮雜-2'-脫氧胞苷對人胃癌細胞株BGC803生長及死亡相關蛋白激酶基因表達的影響

沈薇 胡金瑤 高偉 趙慧

沈陽醫學院基礎醫學院，遼寧沈陽110034

目的探討去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對人胃癌細胞BGC803增殖、凋亡及對死亡相關蛋白激酶（DAPK）mRNA表達水平的影響。方法用不同濃度的5-Aza-CdR處理BGC803細胞，設立不含5-Aza-CdR的對照組及3個實驗組：5-Aza-CdR 1 μmol/L組、5-Aza-CdR 5 μmol/L組、5-Aza-CdR 10 μmol/L組。CCK-8檢測細胞的增殖情況，AnnexinⅤ/PI雙染及流式細胞術檢測藥物處理后細胞凋亡的情況，RT-PCR檢測用藥前后DAPK mRNA的表達水平變化。結果實驗組BGC803細胞增殖速度顯著低于對照組，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。RT-PCR結果顯示，BGC803細胞中DAPK基本無表達，5-Aza-CdR處理后，細胞中DAPK mRNA表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。結論5-Aza-CdR抑制BGC803細胞增殖，并促進細胞凋亡，可能與其誘導DAPK基因表達有關。

5-氮雜-2'-脫氧胞苷曰死亡相關蛋白激酶曰胃癌曰細胞增殖曰細胞凋亡

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，每年因胃癌死亡的人數位居癌癥死因第2位[1]。胃癌的發生發展是涉及多個基因的復雜過程，與抑癌基因的異常改變密切相關。腫瘤表觀遺傳學認為基因啟動子區CpG島甲基化是抑癌基因表達下調甚至失活的重要機制，但這種變化是可逆轉的，去甲基化藥物能夠逆轉抑癌基因啟動子甲基化狀態，恢復其正常表達[2]。死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一種凋亡正向調節分子，可被腫瘤壞死因子α、神經酰胺、細胞外基質（ECM）存活信號和pl9AFR5等多種因子激活，進而誘導凋亡[3]。有研究表明在頭頸部腫瘤、胃癌、肺癌及膀胱癌等多種腫瘤細胞中，DAPK啟動子區域DNA高甲基化水平與該基因表達沉默有關[4-7]。Satoh等[8]發現15%的胃癌組織存在DAPK基因啟動子區CpG島甲基化。本文以人胃癌BGC803細胞株為研究對象，研究體外去甲基化藥物5-雜氮-2'脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）對胃癌細胞株增殖、凋亡及細胞中DAPK基因的表達影響，為探討胃癌的發生發展機制及治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

BGC803細胞來源于中國醫科大學遺傳學教研室，5-Aza-CdR購自美國Sigma公司，CCK-8購自北京碧云天公司，RPMI1640培養基購自Gibco公司，總RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒，GoTaq Master Mix購自美國Promega公司，AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組及藥物處理RPMI1640培養液（含10%小牛血清，100 μ/mL青霉素，100 μ/mL鏈霉素）在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養BGC803細胞。培養至60%匯合度時，對照組使用不含5-Aza-CdR的普通完全培養液，實驗組分別為加入不同濃度5-Aza-CdR處理液分別記為5-Aza-CdR 1 μmol/L組、5-Aza-CdR 5 μmol/L組、5-Aza-CdR 10 μmol/L組，每隔24小時換液1次。

1.2.2 CCK-8檢測細胞增殖變化將各組BGC803細胞按1500/孔接種96孔板，每組設3個復孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細胞培養箱內孵育4 h，測定450 nm波長OD值，連測3 d，以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。以上實驗重復3次。

1.2.3 AnnexinⅤ/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率變化細胞傳代24 h后，實驗組將5-Aza-CdR 10μmol/L濃度配制的培養液加入培養瓶中，對照組換普通培養掖，每24小時換液1次。待72 h后分別回收細胞，制成單細胞懸液，再用PBS離心洗滌，調整待測細胞密度為1×106個/mL。取1 mL細胞，1000 r/min,4℃離心10 min，棄上清液，加入PBS清洗細胞2次，將細胞重懸于100 μL結合緩沖液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和10 μL PI輕輕混勻，避光室溫孵育15 min后，加入400 μL結合緩沖液，立即FCM檢測。

1.2.4 半定量RT-PCR檢測各組細胞DAPK mRNA表達變化用總RNA提取試劑盒提取5-Aza-CdR 10 μmol/L組不同處理時間（0、24、48、72 h）的細胞內RNA，用兩步法將RNA逆轉成cDNA后進行PCR實驗，DAPK引物序列為5'-GATAGAAATGTCCCCAAA-3'（上游）；5'-TCTTCTTTGGATCCTTGA-3'（下游），長度為343 bp。作為內參的人β-actin引物序列為5'-CCAGATCATGTTTGAGACCT-3'（上游）；5'-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3'（下游），長度為480 bp。擴增反應條件：95℃ 5 min變性，95℃復性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環，72℃延伸10 min，4℃暫時保存。實驗重復3次。產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統（Tanon-2500 R）拍照及分析表達情況。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件，正態分布計量資料以均數±標準差（s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5-Aza-CdR對胃癌細胞株BGC803增殖的影響

與對照組比較，5-Aza-CdR 5 μmol/L組和5-Aza-CdR 10 μmol/L組的細胞在藥物作用72 h后增殖力顯著降低（P＜0.05）。而且隨藥物濃度的增加，細胞的生長抑制越明顯。見圖1。

圖1 5-Aza-CdR對胃癌BGC803細胞增殖的影響

2.2 5-Aza-CdR對胃癌細胞株BGC803凋亡率的影響

實驗組的細胞在藥物處理72 h后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。對照組和實驗組的細胞凋亡率分別為（5.47±1.22）%和（10.55±1.24）%，實驗組細胞凋亡率較對照組顯著增加（P＜0.05）。見圖2。

2.3 5-Aza-CdR對胃癌BGC803細胞DAPK mRNA表達的影響

半定量RT-PCR結果表明，BGC803細胞在正常培養條件下DAPK基因表達明顯受到抑制，10 μmol/L的5-Aza-CdR處理后，細胞DAPK mRNA表達水平明顯升高[0 h：（0.223±0.056），24 h：（0.403±0.019），48 h：（0.705±0.018），72 h：（0.768±0.037）]，差異有統計學意義（P＜0.05），且有時間依賴性。見圖3。

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，指在DNA甲基化轉移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結合一個甲基基團。DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則使基因重新活化和表達。抑癌基因啟動子區域CpG島高度甲基化可導致相關基因表達沉默，從而直接參與、影響或調控腫瘤的發生發展過程，是癌癥發生的重要機制[9]。由于DNA甲基化修飾不涉及DNA序列改變，這種改變是可逆的。5-Aza-CdR是一種高效的DNA甲基轉移酶（DNMT）抑制劑,它可與DNMT不可逆性結合，具有較強的去甲基化作用，恢復表觀遺傳學沉默的基因的表達水平，糾正腫瘤細胞的異常生物學特征[10-11]。目前5-Aza-CdR已在臨床急性粒細胞白血病的治療中得到較成功的應用[12]。Wang等[13]報道，胃癌SGC7901和BGC823細胞經5-Aza-CdR處理后，細胞增殖明顯受到抑制。本研究用不同濃度去甲基化藥物（5-Aza-CdR）處理胃癌細胞BGC803細胞72 h后，發現5-Aza-CdR能明顯抑制細胞的增殖。

本研究顯示，5-Aza-CdR對胃癌BGC803細胞具有誘導凋亡的作用。腫瘤細胞凋亡受眾多凋亡相關基因調控。DAPK是一種鈣調蛋白調節的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于細胞凋亡的正調控因子，廣泛參與多種途徑介導的細胞凋亡[14]。在多種腫瘤中已發現DAPK基因CpG島有不同程度的高甲基化，DAPK表達明顯受到抑制[15-16]。本研究發現胃癌BGC803細胞中DAPK mRNA表達水平很弱，使用10 μmol/L 5-Aza-CdR處理細胞后，可恢復DAPK mRNA表達并呈時間依賴性升高，并且基因的表達狀況與細胞的生長狀況平行。由此提示，5-Aza-CdR可能通過恢復DAPK基因CpG島的去甲基化水平，使基因恢復其轉錄活性，從而誘導其重新表達，發揮DAPK的腫瘤抑制作用。其具體甲基化的改變狀態尚需進一步研究。

綜上所述，本研究發現5-Aza-CdR抑制胃癌細胞BGC803增殖及誘導凋亡，可能與其去甲基化恢復DAPK基因表達及功能有關，這為胃癌的診斷及去甲基化治療提供了依據。

圖2 5-Aza-CdR對胃癌BGC803細胞凋亡率的影響

圖3 5-Aza-CdR處理不同時間后DAPK mRNA表達情況

[1]徐飚，王建明.胃癌流行病學研究[J].中華腫瘤防治雜志，2006，13（1）：1-7.

[2]Fukushige S，Horii A.DNA methylation in cancer：a gene silencingmechanismandtheclinicalpotentialofitsbiomarkers[J].Tohuku J Exp Med，2013，229（3）：173-185.

[3]Raveh T，Dorguett G，Horwitz MS，et al.DAPKinase activates a pl9ARF/p53-mediated apoptotic check point to suppress oncogenic transformation[J].Nat Cell Biol，2001，3（1）：1-7.

[4]Widschwendter A，Muller HM，Fiegl H，et al.DNA methylation in serum and tumors of cervical cancer patients[J]. Clin Cancer Res，2004，10（2）：565-571.

[5]肖述兵，萬金龍，彭碧華，等.胃癌中DAPK1表達及其與臨床病理因素的相關性研究[J].國際檢驗醫學雜志，2012，33（12）：1434-1437.

[6]Toyooka S，Toyooka KO，Miyajima K，et al.Epigenetic downregulation of death-associated protein kinase in lung cancer[J].Clin Cancer Res，2003，9（8）：3034-3041.

[7]趙敏，李智，于永春，等.死亡相關蛋白激酶啟動子區甲基化狀態與膀腕癌的關系[J].同濟大學學報：醫學版，2006，27（3）：29-32.

[8]Satoh A，Toyota M，Itoh F，et al.DNA methylation and histone deacetylation associated with silencing DAP kinase gene expression in colorectal and gastric cancer[J].Br J Cancer，2002，86（11）：1817-1823.

[9]Yan PS，Chen CM，Shi H，et al.Applications of CpG island microarrays for high-throughput analysis of DNA methylation[J].J Nutr，2002，132（8）：S2430-S2434.

[10]Lindner DJ，Wu Y，Haney R，et al.Thrombospondin-1 expression in melanoma is blocked by methylation and targeted reversal by 5-Aza-deoxycytidine suppresses angiogenesis[J].Matrix Biol，2013，32（2）：123-132.

[11]吳芳，胡春宏.5-氮雜-2'-脫氧胞苷逆轉人非小細胞肺癌A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性[J].中華腫瘤雜志，2011，33（5）：349-353.

[12]Zhang F，Dai X，Wang Y.5-Aza-2'-deoxycytidine induced growth inhibition of leukemia cells through modulating endogenous cholesterol biosynthesis[J].Mol Cell Proteomics，2012，11（7）：M111-M169.

[13]Wang HL，Wang XQ，Li Y，et al.Effects of 5-Aza-2'-deoxycitydine on proliferation of human gastric cancer cell lines and abnormal methylation of Apaf-1 gene[J].Shi Jie Hua Ren Xiao Hua Za Zhi，2007，15（3）：221-227.

[14]Li C，Wang L，Su J，et al.mRNA expression and hypermethylation of tumor suppressor genes apoptosis protease activating factor-1 and death-associated protein kinase in oral squamous cell carcinoma[J].Oncol Lett，2013，6（1）：280-286.

[15]謝海，仇小強，余紅平，等.5-氮雜-2'-脫氧胞苷對人肝癌細胞株SMMC7721增殖及DAPKmRNA表達的影響[J].廣西醫科大學學報，2012，29（1）：13-16.

[16]Yamaguchi S，Asso T，Nakamura J，et al.High frequency of DAP kinase gene promoter methylation in colorectal cancer specimens and its identification in serum[J]. Cancer Lett，2003，194（1）：99-105.

Effects of 5-Aza-CdR on cell proliferation and DAPK gene expression in human gastric cancer cell line BGC803 cells

SHEN WeiHU JinyaoGAO WeiZHAO HuiCollege of Basic Medicine,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang110034,China

Ojective To explore the effects of DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-CdR)on the proliferation,apoptosis and the expression level of tumor suppressor gene DAPK in human gastric cancer cell line BGC803 cells.Methods BGC803 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR and divided into four groups,including control group,5-Aza-CdR 1 μmol/L group，5-Aza-CdR 5 μmol/L group and 5-Aza-CdR 10 μmol/L group.Cell counting Kit-8 was employed to detect cell proliferation,cell apoptosis was measured by AnnexinⅤ/PI apoptosis detection kit,RT-PCR was applied to detect the DAPK mRNA expression.Results The proliferation of BGC803 cells was significantly inhibited in a dose-dependent manner compared with control group,after 5-Aza-CdR treatment,the apoptotic rates of cells increased significantly(P＜0.05).The expression levels of DAPK mRNA was gradually increased in a time-dependent manner(P＜0.05).Conclusion 5-Aza-CdR inhibited cells proliferation,promoted cells apoptosis and induced the expression of DAPK gene in BGC803 cells.

5-Aza-2'-deoxycytidine;Death-associated protein kinase;Gastric cancer;Cell proliferation;Cell apoptosis

R734.2

A

1673-7210（2014）11（b）-0014-04

2014-08-10本文編輯：蘇暢）

遼寧省教育廳杰出青年學者成長計劃（編號LJQ 2012091）；遼寧省大學生創新訓練計劃項目（編號2013101 64002）；沈陽醫學院大學生科研立項項目（編號20139002）。

沈薇（1976-），女，博士，副教授，主要從事腫瘤發展和轉移的分子機制研究。