TOLL樣受體2及4在脊柱關節炎患者外周血CD14+單核細胞表面的表達及意義

王衛遠 李志軍 王濤 李俊芳

1.河北省邯鄲市中心醫院免疫科，河北邯鄲056001；2.蚌埠醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，安徽蚌埠233004

TOLL樣受體2及4在脊柱關節炎患者外周血CD14+單核細胞表面的表達及意義

王衛遠1李志軍2王濤2李俊芳1

1.河北省邯鄲市中心醫院免疫科，河北邯鄲056001；2.蚌埠醫學院第一附屬醫院風濕免疫科，安徽蚌埠233004

目的觀察脊柱關節炎（SpA）患者外周血CD14+單核細胞Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）的表達變化及其與臨床指標的關系，探討其在SpA的發病中的作用。方法選擇2008年7月～2009年1月蚌埠醫學院第一附屬醫院風濕免疫科確診SpA患者71例，并選擇30名健康體檢者作為正常對照組。采用流式細胞術檢測外周血CD14+單核細胞表面TLR2、TLR4陽性細胞的表達的百分率及平均熒光強度（MFI）。根據BASDAI評分將SpA患者組分為活動組54例（BASDAI評分＞4分）和非活動組17例（BASDAI評分≤4分），分別比較活動組、非活動組和正常對照組三組間TLR2、TLR4陽性細胞表達百分率和MFI的差異，并分析TLR2、TLR4陽性細胞表達百分率和MFI與相關臨床和實驗室指標的相關性。結果TLR2+外周血CD14+單核細胞的表面表達百分率在活動組、非活動組及正常對照組間差異無統計學意義（均P＞0.05）。TLR2+外周血CD14+單核細胞表面MFI在各組間差異無統計學意義（均P＞0.05）。TLR4+外周血CD14+單核細胞的表面表達的百分率在活動組和非活動組[（42.5±11.1）%、（32.9±9.4）%]與正常組相比[（22.3±7.5）%]，差異有高度統計學意義（P＜0.01），活動組和非活動組之間相比差異有高度統計學意義（P＜0.01）。TLR4+外周血CD14+單核細胞的MFI在各組間比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。TLR4+外周血CD14+單核細胞的表面表達的百分率與ESR和IgA呈正相關（P＜0.05），TLR2+外周血CD14+單核細胞的表面表達的百分率與ESR和IgG呈正相關（P＜0.05）。結論TLR4在SpA患者外周血CD14+單核細胞表面表達有顯著性變化，提示TLR4可能與SpA發生及病情存在一定的關聯，TLR4和TLR2的表達可作為疾病活動度的參考指標。

Toll樣受體；脊柱關節炎；單核細胞；流式細胞術

脊柱關節炎（spondyloarthropathy，SpA）是一組具有共同特征的相互關聯的侵犯脊柱、外周關節和關節周圍組織的多系統炎性疾病的總稱，嚴重者可發生脊柱畸形和關節強直，其病因至今尚不明確。有研究表明，感染可能是其發病因素之一。目前普遍認為，微生物可能通過感染宿主使其產生免疫應答促使SpA發病。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為一種模式識別受體，在抗感染與免疫信號的轉導過程中起重要作用，TLRs激活后引發細胞的信號轉導最終導致炎性介質的釋放，啟動炎癥和適應性免疫應答。目前的研究認為，TLRs在多種免疫介導性疾病中發揮了重要作用，SpA也是一種免疫性疾病，但目前有關TLRs與SpA的研究甚少[1]。本研究采用流式細胞術測定了SpA患者CD14+單核細胞表面TLR2和TLR4表達的百分率及平均熒光強度（mean fluorescence intension，MFI），并與正常對照進行比較。同時，分析SpA患者CD14+單核細胞表面TLR2和TLR4表達的百分率與有關臨床和實驗室指標的相關性，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2008年7月～2009年1月蚌埠醫學院第一附屬醫院風濕免疫科確診的SpA患者71例，SpA患者診斷均符合1991年ESSC制訂的SpA分類標準[2]，其中，強直性脊柱炎、銀屑病關節炎、反應性關節炎、幼年脊柱關節炎、未分化脊柱關節炎又符合各自診斷標準，均有CT證實的骶髂關節炎。排除嚴重肝炎、腫瘤和其他自身免疫病患者，且3個月內未使用激素、免疫抑制劑和生物制劑。所有患者中男61例，女10例；年齡12～54歲，平均（27±10）歲；其中，強直性脊柱炎49例，反應性關節炎4例，幼年脊柱關節炎8例，銀屑病關節炎2例，未分化脊柱關節炎8例。所有SpA患者參照BASDAI評分評定病情活動，分為活動組54例（BASDAI評分＞4分）和非活動組17例（BASDAI評分≤4分）。選擇蚌埠醫學院第一附屬醫院健康志愿者30名作為正常對照，其中，男26例，女4例，年齡18～41歲，平均（26±6）歲，均無SpA既往史和家族史，排除其他自身免疫性疾病和感染性疾病表現。各組間性別和年齡等一般情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑與儀器

熒光素FITC小鼠抗人CD14單抗（克隆號H1221購自天津協和干細胞基因工程有限公司），TLR2-PE（克隆號TL2.1，購自Ebioscience公司），TLR2-PE（克隆號TTA123，購自Ebioscience公司），流式細胞儀（美國B-D公司FACS Calibur），氯化氨溶血劑和PBS洗液為蚌埠醫學院免疫學實驗室自行配制。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞染色抽取患者和正常人肘靜脈血2 mL于抗凝管中，每份標本分裝5管，從第2管開始，依次加入CD14-FITC 4 μL、TLR2-PE 4 μL或TLR4-PE 4 μL于管底，用鼠IgG2a抗體作為同型對照；然后加30 μL的抗凝全血混勻，置室溫避光孵育20 min，加入3 mL/管氯化氨溶血劑，充分混勻后室溫避光15 min，以破壞紅細胞。將試管置于離心機，以1500 r/min離心5 min，吸去上清液；2 mL/管PBS液（pH 7.2）洗滌2次，1500 r/min離心5 min，吸去上清液。加入PBS液（pH 7.2）300 μL，流式細胞術檢測。同樣處理的細胞設置未加熒光抗體對照管，用小鼠Ig2a-PE作表面染色的同型對照管，僅做表面染色抗人CD14-FITC單色熒光抗體染色作為調試流式細胞儀熒光補償管。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞表面受體數據獲取及分析在流式細胞儀上用Cellquest軟件檢測待測樣品，利用未染色管和單熒光抗體染色管設置光電倍增管（PMT）電壓和熒光補償，利用同型對照管區分是否有非特異性染色，利用未染色管和同型對照管設置陰陽界限，然后對待測樣品進行檢測。每管測定獲取105個細胞的數據。在利用Cellquest軟件分析結果時，首先在前向散射光（forward light scatter，FSC）和側向散射光（side light scatter，SSC）點陣圖上劃定單核細胞區域R1（region 1），然后在FL-1（CD14+-FITC）和FL-2（TLR2-PE或TLR4-PE）點陣圖上設定CD14陽性細胞群為R2，通過設門G2=R1*R2選擇雙陽性單核細胞。選擇FL-2為X軸，G2為門的直方圖，分析TLR2和TLR4的表達百分率及MFI。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；相關分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組CD14+單核細胞表面TLR2/4的表達水平比較

2.1.1 TLR2、TLR4在SpA外周血CD14+單核細胞表面陽性率比較TLR2在SpA活動組、非活動組外周血CD14+單核細胞表面陽性率與正常組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），活動組與非活動組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。TLR4在SpA活動組、非活動組外周血CD14+單核細胞表面陽性率與正常組相比，差異有高度統計學意義（P＜0.01），活動組與非活動組相比差異有高度統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組CD14+單核細胞表面TLR2/4的表達水平（x±s）

2.1.2 TLR2、TLR4在SpA外周血CD14+單核細胞表面MIF的差異TLR2、TLR4在SpA活動組、非活動組外周血CD14+單核細胞表面MIF與正常對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），活動組與非活動組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 TLR2、TLR4的表達水平與臨床指標的相關性

SpA患者外周血CD14+單核細胞TLR2和TLR4的表達與臨床指標相關性分析結果顯示，TLR4表達水平與ESR和IgA呈正相關（P＜0.05），TLR2表達水平與ESR和IgG、IgA呈正相關（P＜0.05）；以上結果提示：SpA患者外周血單核細胞TLR2、TLR4表達水平可作為判斷SpA患者疾病活動度的參考指標。見表2、3。

表2TLR2的表達水平與臨床指標的相關性

表3TLR4的表達水平與臨床指標的相關性

3 討論

SpA最典型的疾病是強直性脊柱炎，還包括反應性關節炎、銀屑病關節炎、炎性腸病關節炎、幼年脊柱關節炎及未分化脊柱關節炎，起病隱匿，致殘率高。目前研究認為，SpA是一種與HLA-B27不同程度相關、細菌感染誘發及機體免疫異常等多因素參與的自身免疫性疾病[3]。盡管SpA發病中觸發感染的證據甚少，但天然免疫應答和獲得性免疫應答在脊柱關節炎的形成中均起作用[4]。TLRs是近年來發現的機體感知微生物病原體病激活細胞直接產生免疫的天然免疫受體，TLR可以防止細菌感染宿主，但當不適當的分泌，它能導致慢性炎癥和自身免疫性疾病。它的發現使人們重新審視了天然免疫在SpA發生機制中的作用。

TLRs是進化高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，目前在人類已有13種TLR（TLR1～TLR13）被鑒定出[5]TLR1、2、3、4、5和6表達在細胞表面膜，7、8和9存在于細胞內的膜內。TLR2、TLR4是研究最廣的受體，前者主要表達在單核細胞及樹突細胞上，識別G+菌的肽聚糖；后者表達于單核細胞、巨噬細胞、上皮細胞和內皮細胞，識別G-菌細胞壁的主要成分脂多糖，在天然免疫中，CD14與TLR2/TLR4作為免疫受體，它通過相互間協同作用不但可以識別病原體所特有的病原相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），而且還可特異性識別特定內源性損傷相關分子模式（danger associated molecular patterns，DAMPs）。主要通過MyD88依賴和MyD88非依賴兩條途徑[6-7]：MyD88依賴途徑是目前研究較為清楚的，TLR2/4通過該途徑尚需MAL協助MyD88募集下游IL-1受體相關激酶家族（IL-1 receptor-associated kinase family，IRAK）兩個成員：IRAK-4和IRAK-1，相繼磷酸化，活化后的IRAK-1與MyD88解離，進入胞漿募集可溶性TRAF6（TNFR-associated factor 6），TRAF6在泛素偶聯激酶（ubiqiuitin-conjugating enzyme）作用下形成復合物，該復合物可以激活TAK1激酶，活化的TAK1激酶通過激活IKK復合物活化轉錄因子NF-κB和（或）AP-1，引發促炎細胞因子基因的轉錄和表達，釋放細胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等。簡言之，相互識別后通過耦聯信號傳導途徑，激活天然免疫細胞，最終引起一系列的炎性反應，而且其為激活獲得性免疫提供共刺激信號。因此，TLR是連接天然免疫與獲得性免疫的危險信號受體，可以通過TLR引發免疫應答，參與某些免疫性疾病的發生、發展[8-9]。

Wright等[10]運用蛋白組學方法比較強直性脊柱炎（AS）患者和類風濕關節炎（RA）患者與正常人外周血單核細胞蛋白的表達組成差異，結果顯示在AS和RA患者中遷移的單核細胞、TLRs信號傳導等與正常人顯著不同。最近，Assassi等[11]展示了使用全血基因表達分析表明，TLR4和5的表達顯著增加，但不是在健康對照組或系統性紅斑狼瘡患者。印證了單核細胞的TLRs信號通路在SpA的發病中扮有重要角色。De Rycke等[12]和Yang等[13]已證明TLR2和TLR4在SpA患者血清中、外周血單個核細胞或滑膜組織顯著升高，而且其疾病的活動性與TLR4的上調有關，當這些患者應用抗TNF-α阻滯劑治療，TLR2、TLR4顯著降低，這一現象表明免疫細胞內存在多層次不同靶點的負向調控，可以對TLR4所介導的信號通路的開啟和傳導起到精確的負調控作用，從而抑制TLR4信號轉導[14]。雖然入選的患者無一例應用生物制劑治療，但TLR4的上調仍提示它可能參與SPA的病理過程。

本研究采用流式細胞術檢測71例脊柱關節炎患者外周血CD14+單核細胞上TLR2和TLR4的表達，結果顯示，脊柱關節炎患者外周血和TLR4在CD14+單核細胞陽性率高于健康對照組，且活動期TLR4表達強于靜止期患者。這種高表達可能與其接受感染因子刺激有關，進一步證明感染作為誘因參與SpA的發病，TLR4的高表達也初步提示TLR4及其介導的天然免疫應答與SpA發生發展存在一定相關性。而非活動期患者TLR4的表達雖然低于活動期，但也明顯高于健康對照組，推測其不僅參與了SpA的起病階段，而且在脊柱關節炎后期病情進展中也有重要作用。提示TLR4信號通路參與SpA的發病，活化的單核細胞遷移至病變的關節內，轉化成巨噬細胞，通過TLR識別關節內的PAMP，活化JNK、p38和NF-κB信號傳導通路，啟動機體的炎性反應，并活化獲得性免疫系統，合成和釋放許多炎癥因子，后者除了聚集在關節滑膜上外，還會激活體內配體產生免疫應答，最終導致關節組織和骨組織的破壞[15]。導致SpA炎性反應慢性持續發展。

本研究顯示，TLR2的表達在SpA患者組和正常對照組相比無顯著性差異。然而，Candia等[16]觀察TLR2和TLR4受體在PsA患者單核細胞來源的抗原提呈細胞的表達發現，來自于PsA患者未成熟樹突狀細胞TLR2表達升高，而成熟樹突狀細胞和單核細胞與正常對照和類風濕關節炎患者相比無顯著性差異。TLR4在任何類型細胞中的表達無明顯差異，上清液中細胞因子測定顯示為Th1型，多數表達IL-2、TNF-α及IFN-γ，Western blot分析同樣證實TLR2表達增加，上調的TLR2為天然免疫在PsA中發病機制提供了支持依據。Florence等[17]研究TLR2和TLR4基因多態性在沙門腸道桿菌引發的ReA中發現，與正常人比較TLR4的變異體無顯著性差異，而TLR2（753Q）變異個體易進展為關節炎并具有關節外表現，而TLR2的另外一變異體（631H）男性感染的關節外表現相關。最近報道由Myles等[18]發現經LPS刺激后在肌腱端炎相關的幼年慢性關節炎中發現TLR2和TLR4在外周血和滑夜中單核細胞表達水平增高，并且與健康對照組相比產生較多的IL-6和MMP-3。上述文獻支持單核細胞通過TLR2信號轉導路徑參與SpA的發病，與本實驗結果不符，分析原因可能與本次入組的銀屑病關節炎及反應性關節炎、幼年脊柱關節炎患者偏少相關，增加樣本量及更進一步的分組分層比較也許可以得到相同的結果。人們通過小鼠關節炎模型發現，在類風濕關節炎起始階段通過TLR2活化促進血管的發生[19]，便于炎癥細胞的黏附和侵襲，導致關節軟骨和骨組織的破壞，在后期TLR4增加金屬蛋白酶介導的破壞作用和破骨細胞形成[20]，導致慢性破壞性關節炎[21]。TLR2與TLR4在類風濕關節炎病情進展過程中的相互轉換可能是其中原因之一，是否能夠在脊柱關節炎中得到合理解釋尚需更多試驗佐證。

ESR和血漿CRP是反映各種炎癥活動的急性時相反應物，臨床研究者把ESR和CRP作為判斷治療后SpA患者病情是否穩定的實驗室指標之一。TLR4＋和TLR2＋細胞的比例均與ESR呈正相關，這提示TLR4和TLR2表達與SpA病情活動具有相關性。同時，TLR2＋細胞比例與血清IgG定量呈正相關，TLR4＋細胞的表達與血清IgA定量呈正相關，表明SpA患者存在體液免疫亢進和急性炎癥或組織損傷。因此，TLR2和TLR4表達水平可能作為評論SpA患者病情的生物學標志，阻斷這種結合可能減輕患者的臨床癥狀，但還有很多潛在的機制未能了解和發現，尚需要更深入的研究和發現。

綜上所述，臨床上觀察單核細胞表面TLR2和TLR4的變化可以從一個新的角度客觀地反映機體的免疫狀態，機體激活TLR4受體的表達，產生天然免疫和炎性反應，啟動特異性免疫應答，參與SpA的發病。

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Expression and significance of Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 on CD14+peripheral blood monocyte cells surface of patients with spondyloarthropathy

WANG Weiyuan1LI Zhijun2WANG Tao2LI Junfang1
1.Department of Rheumatology,Handan Central Hospital,Hebei Province,Handan056001,China;2.Department of Rheumatology,the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui Province,Bengbu233004,China

Objective To investigate the effect and possible mechanism of Toll-like receptor-2(TLR2)and Toll-like receptor-4(TLR4)in the development and progress of spondyloarthropathy.Methods 71 SpA patients in the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College from July 2008 to January 2009 were selected,and 26 cases of healthy controls were selected.SpA patients of 54 cases and 17 cases were divided into the active stage group and stable stage group,according to BASDAI score.Flow cytometry analysis was used to detect the expression of CD14+monocyte surface TLR2/4 positive cells,the TLR2 and TLR4 expression rate,the mean fluorenscence intensity(MFI)and the related clinical and laboratory indicators.Results There was no significant differences in the expression rate and MFI of TLR2 on CD14+monocyte in the peripheral blood of SpA patients among the active stage group,stable stage group and healthy control group(P＞0.05).The expression rates of TLR4 in the CD14+monocytes were[(42.5±11.1)%]and [(32.9±9.4)%]respectively in the active stage group and stable stage group,both were higher than that of control group [(22.3±7.5)%],there were significant differences among the three groups(P＜0.01),there was also significant difference between the active stage group and stable stage group(P＜0.01).There was no significant differences in MFI of TLR4 on CD14+monocyte in the peripheral blood of SpA patients among the active stage group,stable stage group and healthy control group(P＞0.05).The expressiong rate of TLR4+correlated positively with ESR and IgA(P＜0.05),the expressiong rate of TLR2+correlated positively with ESR and IgG(P＜0.05).Conclusion The expression pattern of TLR4 on CD14+peripheral blood monocyte cells surface in SpA patients has significant changes.The results indicate that TLR4 play an important role in immune reaction of SpA.The expression of TLR2 and TLR4 in peripheral blood monocytes may help in assessing disease activity in SpA patients.

Toll like receptor;Spondyloarthropathy;Mononcyter;Flow cytometry

R593.23

A

1673-7210（2014）09（a）-0062-05

2014-05-23本文編輯：程銘）