依諾肝素鈉原料藥細菌內毒素檢查方法的研究

張射兵 陸曉和 曲 清 段艷冰，

1.南京健友生化制藥股份有限公司，江蘇南京210061；2.南京軍區南京總醫院，江蘇南京210012

依諾肝素鈉原料藥細菌內毒素檢查方法的研究

張射兵1陸曉和2曲 清1段艷冰1，2

1.南京健友生化制藥股份有限公司，江蘇南京210061；2.南京軍區南京總醫院，江蘇南京210012

目的建立依諾肝素鈉原料藥的細菌內毒素檢查方法。方法按照《中國藥典》2010年版二部，確定合理的依諾肝素鈉細菌內毒素限值，并研究依諾肝素鈉對細菌內毒素與鱟試劑反應的干擾情況，以確定其不干擾試驗濃度。結果確定依諾肝素鈉的細菌內毒素限值為0.01 EU/U，使用2個廠家生產的鱟試劑試驗，本品配制成3 U/mL濃度對反應均無干擾作用。結論細菌內毒素檢查法可用于依諾肝素鈉細菌內毒素的檢查。

依諾肝素鈉；細菌內毒素；干擾試驗

肝素（heparin）是經豬小腸提取的黏多糖類生化藥物，是臨床經典的胃腸外系統應用的抗凝劑，其主要作用機制是抑制凝血X因子和通過與抗凝血酶的相互作用間接抑制凝血酶。肝素與1916年被發現，并與1973年成功地應用于臨床，肝素臨床上的應用是醫學史上劃時代意義的事件，肝素的問世也推動了臨床介入工作的發展。目前肝素在臨床上仍廣泛地應用于血栓栓塞性疾病、體外循環、血液透析、經皮冠狀動脈介入治療等領域。但是肝素由于其分子量大，而且只能通過注射給藥，會有一定比例的不良反應發生。為了克服肝素的不足，臨床上有開發出一系列的低分子肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH）品種，同肝素相比，低分子肝素具有療效明顯、半衰期長、出血不良反應發生率小等優點[1]。低分子肝素可皮下注射，不需要持續的靜脈滴注，其引起血小板減少的發生率相對較低[2]。

低分子肝素是由肝素經過化學或者酶解的方法得到的分子量相對較低的肝素片段。其中依諾肝素是目前臨床使用最為廣泛的低分子肝素。依諾肝素鈉是肝素鈉的芐酯衍生物，經堿裂解而得的低分子量肝素鈉鹽，其平均分子量在3800～5000之間[3]。由于依諾肝素為生物源性的產品，其粗品中帶有很多的生物源性的物質，而且其注射液為無菌分裝產品，因此對于依諾肝素原料進行細菌內毒素的控制，十分有必要。本文參《中國藥典》2010年二部附錄中收載的“細菌內毒素檢查法”和相關文獻資料建立依諾肝素原料中細菌內毒素檢查方法，并對方法可行性進行了研究。

1 儀器與試藥

XW-80A型漩渦混合器（上海精科實業有限公司）；TZL-5004恒溫水浴鍋（蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司）；XS205型電子天平（瑞士Meltler公司）；DHG-9240A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；無熱原吸頭及封口膜（均購自江蘇康華醫藥科技實業中心）。

依諾肝素鈉：規格為原料藥，南京健友生化制藥股份有限公司生產，批號分別為50211202、50211203、50211301，以干燥品計抗Xa效價分別為102、101、101 U/mg。

鱟試劑（TAL）：靈敏度（λ）為0.03 EU/mL，批號為0903130（湛江安度斯生物有限公司產品），批號為09110712（福州新北生化工業有限公司）。細菌內毒素工作標準品（CSE）：中國藥品生物制品檢定所，批號為150601-200861，150 EU/支。細菌內毒素檢查用水（BET用水）：湛江安度斯生物有限公司產品，批號為10012210，細菌內毒素含量小于0.003 EU/mL，規格為50 mL/支。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑（TAL）靈敏度（λ）復核試驗

參照《中國藥典》2010年版二部附錄細菌內毒素檢查法[4]相關規定進行TAL靈敏度復核試驗，結果見表1。結果顯示，所用的鱟試劑靈敏度均在0.5λ~2.0λ范圍內，表明兩個廠家TAL的靈敏度均符合規定。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗

2.2 供試品細菌內毒素限值（L）的確定

參照《中國藥典》2010年版二部附錄細菌內毒素檢查法項下內毒素限值的計算公式：L=K/M，式中L為供試品的細菌內毒素限值以EU/mg表示；K為按規定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，以EU/（kg·h）表示；M為人用每千克每小時最大劑量，以mg/（kg·h）表示。依諾肝素鈉應用于臨床為注射劑皮下或者靜脈給藥，K值規定為5 EU/（kg·h）；查閱依諾肝素鈉注射液說明書[5]得知，人用每千克每小時的最大依諾肝素鈉劑量M為150 U/（kg·h），計算其細菌內毒素限值L為0.03 EU/U。《美國藥典》35版[6]規定依諾肝素原料及注射液的細菌內毒素限值均為0.01 EU/U。結合生產實際，為了嚴格控制產品質量，并參照國內報道的注射用細菌內毒素的限值，本試驗最終擬定依諾肝素鈉原料藥細菌內毒素的限值為0.01 EU/U。

2.3 供試品的最小有效稀釋濃度

最小有效稀釋濃度C=λ/L，其中：λ為鱟試劑的靈敏度（EU/U）；L為依諾肝素原料藥的細菌內毒素限值（EU/mg）。本品為原料藥，確定最小有效稀釋倍數（MVC），當L=0.01 EU/U，取靈敏度（λ）0.03 EU/mL的鱟試劑，由公式C=λ/L計算出供試品的最小有效稀釋濃度為3 U/mL。

2.4 干擾預試驗[7]

取依諾肝素鈉（批號：50211202、50211203、50211 301），分別精密稱取適量，精密加BET用水依次制成濃度為24、12、6、3 U/mL的溶液，記為NPC系列；另制備含有2λ（0.06 EU/mL）細菌內毒素的同一樣品濃度系列，記為PPC系列。用λ為0.03 EU/mL的2個廠家的TAL分別與上述NPC和PPC系列溶液進行反應[7]，每個濃度重復2管，并設陰性對照（NC）和陽性對照（PC）各2管。結果見表2。由干擾預試驗結果可初步了解，供試品溶液稀釋至24、12、6、3 U/mL濃度時，對2個廠家的TAL與細菌內毒素的反應均不存在干擾作用。其中鱟試劑靈敏度λ=0.03 EU/mL。

表2 干擾預試驗

2.5 正式干擾試驗（鱟試劑：靈敏度λ=0.03 EU/mL）

按限值L＜0.01 EU/U計算，用靈敏度λ=0.03 EU/mL的鱟試劑，最小有效稀釋濃度為3 U/mL。故選擇3 U/mL作為供試品溶液的配制濃度。為了進一步確認供試品溶液對λ=0.03 EU/mL的鱟試劑是否存在干擾作用，分別用BET水和濃度為3 U/mL的供試品溶液進行實驗，將洗凈內毒素工作標準品配制成1λ、2λ、0.5λ、0.25λ濃度的系列內毒素溶液。精密稱取依諾肝素鈉（批號：50211202、50211203、50211301）適量，分別用BET用水制成最終濃度為3 U/mL的溶液，用該溶液和BET用水分別將CSE稀釋成含內毒素0.06（2λ）、0.03（1λ）、0.015（0.5λ）、0.0075（0.25λ）EU/mL的系列溶液，用2個廠家λ為0.03 EU/mL的TAL，按《中國藥典》2010年版二部細菌內毒素檢查法進行干擾試驗，結果見表3。

按公式E=antilg（∑X/4）計算并比較系列間的效價值（Es和Et）[8]。0.5λ≤Es（Es′）≤2λ，且0.5 Es（Es′）≤Et（Et′）≤2Es（Es′）。表明在此試驗條件下，依諾肝素鈉的細菌內毒素限值為0.01 EU/U，供試品在濃度為3 U/mL下不干擾細菌內毒素檢測試驗。

表3 干擾試驗

2.6 供試品的細菌內毒素檢查

將3個批號的供試品，用BET水配制成濃度為3 U/mL供試品溶液，然后用λ為0.03 EU/mL的兩個廠家的TAL各8支實驗。參照《中國藥典》2010年版二部附錄[4]進行細菌內毒素檢查，均符合規定。結果見表4。

表4 干擾試驗

3 討論

依諾肝素鈉為生化類抗凝藥物，其起始原料為主小腸的提取物肝素，因此此類生化藥物中多含有較多的蛋白等雜質，在產品生產過程中除蛋白是關鍵的步驟之一[9]。而依諾肝素鈉制劑是預充針的無菌分裝品種，制劑生產過程中往往不能再增加除熱原的步驟，因此在原料中指定細菌內毒素的限量是十分必要的。為提高藥品質量標準，更有效地控制藥品質量，依據《中國藥典》2010年版二部凡例二十二條“同一原料藥用于不同制劑時，需根據臨床用藥要求制訂相應的質量控制項目”的要求，制訂該原料藥的安全性檢查項目是非常必需的[10]。

將依諾肝素鈉原料藥細菌內毒素限值定在0.01 EU/U與其注射劑限值[11]相同，這個限度可以很好地保證注射劑的生產和臨床使用上的安全性。采用2個廠家的TAL對3批樣品進行干擾試驗及用不同廠家、不同靈敏度的TAL對3批樣品進行方法學驗證試驗，結果表明，當樣品稀釋至3 U/mL濃度時對TAL與細菌內毒素的反應無干擾作用，方法學驗證結果也符合細菌內毒素檢查法有效性的規定。因此，依諾肝素鈉原料藥采用內毒素檢查法（鱟試劑法）是可行的，具體檢查方法：取本品，依照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE方法[3]，每單位依諾肝素鈉中含內毒素的量應小于0.01 EU。因樣品獲取困難，本試驗僅使用了1家廠家的3批樣品，考慮到細菌內毒素檢查法是一項復雜的酶促反應過程[12]，影響因素多，如要真正將該品種的細菌內毒素檢查法載入國家標準，還有待于積累更多的試驗數據。該方法目前可先在廠內中間體的質量控制中予以運用。

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[3]TheEuropeanPharmacopoeiaCommission.TheEuropeanPh armacopoeia[S].7th.Strasbourg：EDQM，2008：1097.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄99-101.

[5]依諾肝素鈉注射液說明書.Bridgewater：NJ 08807 USA.

[6]United States Pharmacopeia Commission.United States Ph armacopeia[S].30th.USA：American Pharmacopeia，2007，USP30-NF25：3040-3042.

[7]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：310-320.

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[9]李京，范慧紅，徐康森.低分子肝素藥用現狀及質量標準概況[J].中國生化藥物雜志，2004，25（1）：53-55.

[10]余立，趙慧玲，陸益紅，等.依諾肝素鈉藥學研究資料基本要求[EB/OL].國家藥審中心電子刊物，http：//www.cde. org.cn/d2kw.do?method=largepage&id=311935.htm. 2010-11-15.

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[12]許雷鳴，武谷，顧倩.門冬氨酸鳥氨酸注射液細菌內毒素檢查法的研究[J].中國醫藥導報，2013，10（6）：100-102.

Study on bacterial endotoxiin test method for Enoxaparin Sodium

ZHANG Shebing1LU Xiaohe2QU Qing1DUAN Yanbing1，2
1.Nanjing King-friend Biochemical Pharmaceutical Co.,LTD.,Jiangsu Province,Nanjing210061,China;2.Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA,Jiangsu Province,Nanjing210012,China

ObjectiveTo establish a method of examining bacterial endotoxin for Enoxapain sodium.MethodsThe reasonable limit of endotoxin was determined by using Chinese Pharmacopoeia(2010 edition,2 volume),and study on testing for bacterial endotoxin to determine the noninterference concentration for Enoxaparin Sodium.ResultsThe most suitable limit of bacterial endotoxin in preparation for Enoxaparin Sodium was 0.01 EU/U and the TAL of two manufacturers was used to test,and it was proved that the best noninterference concentration was 3 U/mL.ConclusionIt is showed that,the method is suitable for the Enoxaparin Sodium of bacterial endotoxin test.

Enoxaparin Sodium;Bacterial endotoxin test;Interference test

R331

A

1673-7210（2014）04（c）-0092-04

2013-11-14本文編輯：衛軻）

江蘇省科技成果轉化專項資金項目（編號BA20 12033）。

張射兵（1985-），男，江蘇鹽城人，南京中醫藥大學2009級藥學專業在讀碩士研究生；研究方向：化藥研究和藥品注冊工作。

段艷冰（1978-），男，博士，副主任藥師；研究方向：創新藥的研究和管理工作。