雪蓮黃酮膠囊對低壓低氧模型小鼠行為學影響及腦組織的保護作用*

石志群 李 琳 張 潔 蔡 楠 田貽婷 馬慧萍

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院藥劑科全軍高原醫學實驗室,蘭州 730050) (2.中國中醫科學院 中藥研究所,北京 100700)

中樞神經系統對氧非常敏感,高原低壓低氧環境會對中樞神經系統造成一定的損傷,嚴重影響進入高原人群的認知能力,并引發多種嚴重的病理變化,如大腦麻痹、反應延遲、學習能力與記憶力減退、癲癇,以及失眠頭暈情緒改變等多種精神紊亂[1]。海拔5 000 m以上的慢性缺氧會對人腦造成神經性損傷,在返回低海拔區域之后損傷甚至會持續一年以上,即使是急性減壓1 h,人的短期記憶也會衰退[2]。

前期實驗表明[3],本課題組采用低壓低氧動物實驗艙模擬高原缺氧環境對小鼠腦組織造成了嚴重的缺氧損傷,神經元細胞形態發生改變、為腦組織提供能量的線粒體數量大幅度減少,有氧呼吸所依靠的嵴消失,線粒體破裂,還引起腦組織各項生化指標的改變,對腦組織的正常功能造成了一定影響。為進一步研究雪蓮黃酮膠囊對急性高原缺氧腦組織的保護能力,本實驗選擇Morris水迷宮作為評價腦損傷小鼠的學習和記憶能力,并檢測線粒體膜電位及復合物活力、缺氧相關基因蛋白的表達情況,從行為學及基因表達方面評價雪蓮黃酮膠囊對急性高原病的防治能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:SPF級雄性BALB/c小鼠80只,體質量18～22 g,購自蘭州生物制品有限公司,實驗動物生產許可證號【SCXK(甘)2017-0001】,實驗動物使用許可證號【SYXK(軍)2017-0047】,實驗動物處理遵守聯勤保障部隊第940醫院審批,實驗動物倫理審批號:2015GKJ017。

1.1.2試劑與儀器:乙酰唑胺(武漢遠城科技發展有限公司);雪蓮黃酮膠囊(中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院);BCA蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所);線粒體膜電位試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);RNAiso Reagent、TaKaRa Prime ScriptTM reagent Kit、PCR擴增試劑盒(均為大連寶生物公司),引物委托寶生物工程公司合成;HIF-1α抗體、VEGF抗體、SOD抗體(均為Abcam公司);Western BrightTM ECL(Advansta公司);DYC-3070型低壓低氧動物實驗艙(中航工業貴州雷航空軍械有限責任公司);SpectraMax i3全自動熒光酶標儀(Molecular Devices公司);HP8453二級管陣列紫外可見分光光度計(惠普公司);蛋白電泳轉膜系統(伯樂公司);Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及處理:取SPF級雄性BALB/c小鼠共80只,飼養適應3 d后隨機分成正常組(N)、模型組(M)、乙酰唑胺組(ACZ,250 mg/kg)和雪蓮黃酮膠囊組(XLJN,500 mg/kg),每組20只,單次灌胃給藥。正常組小鼠不缺氧,其余各組小鼠給藥50 min后放入模擬8 000 m海拔環境,維持缺氧9 h,小鼠完成減壓后每組隨機取10只進行水迷宮訓練,剩下的收集腦組織,-80 ℃冰箱凍存,待用。

1.2.2Morris水迷宮實驗:將水迷宮分為4個象限,在第二象限放置一平臺,進行空間學習訓練,并記錄小鼠潛伏時間與游泳路徑。第6天上午進行定位導航實驗,撤離平臺,將小鼠面向池壁從原平臺的對側象限入水點放入水中,記錄60 s內小鼠的游泳軌跡、總搜索路程、原平臺位置穿越次數、原平臺象限進入次數。

1.2.3線粒體膜電位的測定:取各組小鼠腦組織0.1 g左右,切碎,加入10倍量分離緩沖液[4],放置在盛有冰水混合物的器皿中充分研磨,使組織勻漿化,3 000 r/min離心2 min,棄沉淀,上清液以12 000 r/min離心,棄去上清,沉淀加入0.25 mmol/L蔗糖得到線粒體重懸液,按說明書操作使用熒光酶標儀進行測量。

1.2.4線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ功能的測定:線粒體呼吸鏈復合體 Ⅰ 功能測定:NADH + CoQ + H+→ NAD++ CoQH2,測定方法參考文獻[4],30 ℃孵育5 min;600 nm連續掃描2 min。線粒體呼吸鏈復合體 Ⅱ 功能測定:琥珀酸 + CoQ + H+→ 延胡索酸+ CoQH2,測定方法見參考文獻[5],30 ℃孵育5 min,600 nm掃描2 min。線粒體呼吸鏈復合體 Ⅲ 功能測定:CoQH2+ 2 ferricytochrome C→ CoQ + 2 ferrocytochrome C+2 H+,測定方法見參考文獻[6],30 ℃孵育5 min,550 nm掃描2 min。

1.2.5RT-PCR測定mRNA表達水平:向缺氧后的小鼠腦組織中加入1 mL RNAiso Plus試劑研磨,加200 μL三氯甲烷,混勻后離心棄上清液,用75%乙醇溶液純化總RNA沉淀,再次離心棄上清進行反轉錄,具體步驟參照PrimeScriptTM RT reagent Kit說明書進行。Real-time PCR檢測:步驟依照Applied Biosystems公司7300儀器說明進行實驗。反應條件如下:兩步法PCR擴增,95 ℃預變性30 s;95 ℃反應5 s,60 ℃退火31 s,40個循環。引物及序列見表1。

表1 Real- time RT- PCR引物序列Table 1 Real-time RT-PCR primer sequences

1.2.6蛋白質印跡法測定HIF-1α、VEGF、SOD蛋白的表達:取小鼠腦組織,按照配方提取腦組織蛋白,BCA法對總蛋白濃度進行定量,加入上樣緩沖液,混勻,沸水煮5 min使蛋白變性。采用SDS-PAGE進行電泳、轉膜和抗體孵育。次日配制ECL發光液,進行顯影,用ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

2 結果

2.1 雪蓮黃酮膠囊對低壓低氧模型小鼠行為學的影響

2.1.1空間學習結果:與正常組相比,缺氧模型組在第3天訓練后,潛伏時間明顯延長,游泳路徑雜亂無序。與模型組相比,雪蓮黃酮膠囊組和乙酰唑胺組均可縮短潛伏時間,且具有顯著性差異。潛伏時間變化見表2,游泳路徑變化見圖1(以第1天和第5天為例)。

圖1 雪蓮黃酮膠囊對低壓低氧模型小鼠水迷宮游泳路徑變化的影響Fig.1 Effect of Saussurea flavone capsule on swimming path changes in water maze in low-pressure and hypoxic mice

表2 雪蓮黃酮膠囊對低壓低氧模型小鼠水迷宮實驗潛伏時間的影響Table 2 Effect of Saussurea flavone capsule on latency time of water maze test in low-pressure and hypoxic

2.1.2運動路徑與距離的影響:與正常組相比,模型組進入原平臺所在象限的次數減少,有效象限中的運動距離百分比縮短(P<0.05)。雪蓮黃酮膠囊組小鼠進入有效象限的次數、運動距離百分比均顯著高于模型組(P<0.01),且與正常組無顯著性差異。乙酰唑胺也可提高小鼠在有效象限的運動百分比,但在次象限的運動距離與模型組相比并無顯著差異,如表3所示。

表3 雪蓮黃酮膠囊對有效區域運動路徑與距離的影響Table 3 Effect of Saussurea flavone capsule on movement path and distance in effective region

2.1.3穿越平臺情況的影響:與正常組相比,模型組小鼠進入有效區域次數、穿越平臺次數減少(P<0.05)。雪蓮黃酮膠囊組有效區域次數、穿越平臺次數均顯著高于模型組(P<0.05),與正常組無顯著性差異,如表4所示。

表4 定位航行實驗有效區域進入次數Table 4 Entry times of effective area for

2.2 雪蓮黃酮膠囊對低壓低氧模型小鼠腦組織線粒體膜電位的影響

與正常組膜電位(0.442±0.027)相比,模型組線粒體膜電位(0.281±0.022)下降,線粒體膜電位去極化程度增強,線粒體膜電位降低,差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組相比,乙酰唑胺組(0.384±0.057)和雪蓮黃酮膠囊組(0.407±0.031)的線粒體膜電位上升,具有統計學差異(P<0.01)。

2.3 雪蓮黃酮膠囊對低壓低氧模型小鼠腦組織線粒體復合物電位的影響

與正常組相比,模型組腦組織線粒體復合物I的活性顯著降低,復合物Ⅱ缺氧后無顯著變化,復合物Ⅲ活力降低但與正常組相比無顯著性差異;與模型組相比,乙酰唑胺與雪蓮黃酮膠囊預防給藥組的復合物I活性與模型組相比顯著提高(P<0.01),乙酰唑胺與雪蓮黃酮膠囊預防給藥未能使復合物Ⅱ、復合物Ⅲ的活性發生顯著變化,如表5所示。

表5 雪蓮黃酮膠囊對腦組織線粒體復合物的影響Table 5 Effect of Saussurea flavone capsule on mitochondrial complex in brain

2.4 雪蓮黃酮膠囊對低壓低氧模型小鼠腦組織缺氧相關mRNA的影響

與正常組相比,缺氧小鼠腦組織HIF-1α、VEGF mRNA表達水平顯著提高,SOD mRNA、CAT mRNA水平顯著提降低(P<0.01);與缺氧模型組相比,雪蓮黃酮膠囊組和乙酰唑胺組腦組織HIF-1α、VEGF mRNA表達水平均有所下降,SOD、CAT mRNA表達水平均有所提高(P<0.01)(表6)。

表6 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠心肌組織HIF-1α、VEGF、SOD、CAT mRNA的影響Table 6 Effects of Saussurea flavone capsule on HIF-1α,VEGF, SOD, CAT mRNA in myocardial tissue of mice with simulated altitude

2.5 雪蓮黃酮膠囊對低壓低氧模型小鼠腦組織缺氧相關蛋白含量的影響

與正常組相比,缺氧模型組小鼠腦組織HIF-1α、VEGF含量顯著提高,SOD含量顯著降低(P<0.01,P<0.05);與缺氧模型組相比,雪蓮黃酮膠囊組和乙酰唑胺組小鼠腦組織HIF-1α、VEGF蛋白表達顯著降低(P<0.01,P<0.05),SOD蛋白表達顯著提高(P<0.01)(圖2,表7)。

圖2 雪蓮黃酮膠囊對缺氧小鼠腦組織缺氧相關蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoretic diagram of hypoxic-related protein expression in brain tissues of hypoxic mice induced by Saussurea flavone capsules

表7 雪蓮黃酮膠囊對模擬高原缺氧小鼠腦組織缺氧相關蛋白表達量的比較Table 7 Comparison of brain tissues hypoxic-related protein expression levels of Saussurea flavone capsules in mice with simulated altitude

3 討論

在高原環境下,氧分壓隨海拔升高而降低,進而形成天然的低壓低氧環境。這一獨特的環境特點,對于高原值守作業的部隊官兵以及工作、生活的人們來說,時常要面臨缺氧的風險,影響人們觀察、感知、記憶、思維等方面,更嚴重會造成反應遲緩、記憶困難、注意力下降等,最終造成大腦不可逆性損傷[7]。缺氧條件下,神經元細胞的線粒體數量減少,線粒體膜腫脹、破損,呼吸鏈電子傳遞發生障礙,進而酶活性受到抑制,致使ATP合成減少、自由基產生增多,造成神經元壞死或凋亡,從而出現臨床認知功能下降[8]。水迷宮行為學表明,模型組小鼠學習能力顯著降低,空間記憶力受損,線粒體膜電位去極化程度增強,線粒體膜電位降低,線粒體復合物I活性顯著降低,復合物Ⅱ缺氧后無顯著變化,復合物Ⅲ活力降低但與正常組相比無顯著性差異;而乙酰唑胺或雪蓮黃酮膠囊預防給藥后,小鼠的學習能力與模型組相比明顯提高,線粒體膜電位升高,復合物I活性與模型組相比顯著提高,復合物Ⅱ、復合物Ⅲ的活性未發生顯著變化,表明雪蓮黃酮膠囊可減輕過量自由基造成的損傷,維持ATP酶活性,從而防止高原病的發生,對低壓低氧所造成的腦認知損傷具有良好的預防保護作用。

缺氧誘導因子-l(HIF-1)是高度特異性缺氧狀態下發揮活性的轉錄因子,是專一調節氧穩態的關鍵介質[11],其作為活性氧受體,感受環境中的低氧程度,同時又對起效應器作用的低氧反應基因的轉錄具有調控作用[12]。表皮生長因子(VEGF)為HIF-1的下游基因,它的增多使毛細血管通透性增強,水腫加重[13]。通過RT-PCR檢測缺氧相關基因,缺氧可造成腦組織HIF-1α、VEGF mRNA表達明顯升高,而雪蓮黃酮膠囊可使HIF-1α、VEGF mRNA表達降低,說明雪蓮黃酮膠囊通過降低小鼠腦對于缺氧的敏感性,延緩組織水腫來抵抗缺氧造成的損傷。SOD與CAT是機體清除自由基的主要酶,是抗缺氧能力的重要指標。缺氧可造成模型組SOD、CAT mRNA表達與蛋白含量降低,而雪蓮黃酮膠囊給藥后,缺氧小鼠的SOD、CAT mRNA表達、蛋白含量顯著提高,證明其能夠通過增加缺氧小鼠腦SOD與CAT的含量,提高腦組織的抗氧化能力。

綜上所述,雪蓮黃酮膠囊對低壓性缺氧小鼠所造成的腦認知損傷具有良好的預防保護作用,其保護機制可能與影響HIF-1α、VEGF mRNA的表達、線粒體調節、小鼠組織內部氧平衡、血管生成、提高抗氧化酶含量有關。