大白菜中擬除蟲菊酯類農藥殘留半定量ELISA免疫檢測方法的建立

文孟棠， 劉 媛， 寇莉萍， 劉賢金

(1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100;2.江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所，江蘇 南京210014)

除蟲菊酯類農藥是一類模擬天然除蟲菊酯化學結構合成的農藥，具有殺蟲譜廣、高效、低毒的優點，是目前較理想的農藥。近年來，隨著一批高毒農藥的禁用，菊酯類農藥在中國的使用量越來越大，但因其具有化學性質穩定、不易光解、殘留期長等特點，在農產品中的殘留逐漸引起人們的重視［1］。聯合國糧農組織(FAO)和世界衛生組織(WHO)已對它們在蔬菜和水果等上的殘留作出了嚴格限量［2］。中國針對不同農產品中的不同擬除蟲菊酯類農藥也做了相應的最大殘留限量［3］，主要集中在糧油及其制品、蔬果和茶葉上。

目前，定量測定菊酯類農藥的方法主要為氣相色譜法、高效液相色譜法以及氣相色譜-質譜聯用［4-5］。但是儀器法對被測樣品的凈化要求較嚴格，樣品前處理較為復雜，且對儀器設備和檢測人員的專業知識要求較高，故不適于現場快速檢測［6］。在農藥殘留的監測體系方面，國際上通行的做法是建立快速篩選和儀器分析相結合的雙重監控體制，即在實驗室儀器確證分析之前，按一定規范對受檢產品取樣進行快速檢驗［7］。免疫分析法具有特異性強、靈敏度高、分析容量大等優點，不僅可以特異性地針對某單一化合物，還可用于結構相似的化合物，適合于現場快速檢測大量樣品。

酶聯免疫分析法(ELISA)作為目前使用最普遍的免疫檢測方式，其效率和靈敏度都得到了廣泛認可。針對擬除蟲菊酯類農藥具有相似結構的特點，以其共性結構的化學合成物作為免疫原制備出的光譜性抗體可同時檢測幾種農藥［8］，使得快速檢測的效率顯著提高，適合現場檢測，因為大多數情況下檢測人員只需確定某種類型農藥的殘留。本試驗擬利用實驗室自制的抗擬除蟲菊酯類的廣譜性抗體［9］，優化不同包被抗原和條件，建立對多種擬除蟲菊酯類農藥的半定量ELISA免疫分析快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

酶標儀(Thermo)，洗板機(Thermo)，酶標板(Corning，96 孔)，移液器(Jencons Sealpette)，超純水凈化儀(Labconco)，分析天平(Ohaus)，氮吹儀(Organomation associates)，固相萃取儀(津騰)，高速分散機(麒麟醫用儀器廠生產)，旋轉蒸發儀(Labconic)，水浴鍋(江蘇省東臺市電器廠生產)。

1.2 試劑與材料

大白菜(購于蘇果超市)，擬除蟲菊酯類農藥多克隆抗體(本實驗室自制)，高效氯氟氰菊酯標準品、甲氰菊酯標準品、氟氰戊菊酯標準品、氰戊菊酯標準品、氯氰菊酯標準品、氯菊酯標準品(農業部農藥檢定所提供)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，Mereker)，環二己基碳酰亞胺(DCC，Mercker)，水溶性碳化二亞胺(EDC，Sigma-Aldrich)，二甲基甲酰胺(DMF，Sigma)，6-氨基己酸(上海化學試劑三廠生產)，硫酸銨(上海化學試劑三廠生產)，四甲基聯苯胺(TMB，Sigma)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(武漢博士德公司產品)，H2O2(上海化學試劑公司產品)，SephadexG-10(上海進口分裝產品)，卵清蛋白(OVA，Sigma)，牛血清蛋白(BSA，Sigma)，間苯氧基苯甲酸(PBA，Sigma)，其他試劑均為國產分析純。

1.3 3種包被抗原的合成

活性酯法［10］合成包被抗原1:稱PBA 10.00 mg(0.045 mmol)溶于0.3 ml的DMF，加入等摩爾數的NHS5.18 mg(0.045 mmol)、DCC 9.30 mg(0.045 mmol)，充分混勻后室溫避光靜置過夜。次日10 000 g離心10 min，取上清液緩慢滴加至含10.00 mg(0.000 225 mmol)OVA的5 ml磷酸鹽緩沖液(pH 8.67)，反應液在4℃ 1 L PBS(pH 7.4)中透析3 d，得到包被抗原1。透析液用紫外掃描。

用混合酸酐法［11］合成包被抗原2:稱取11.00 mg(0.05 mmol)半抗原溶于l ml二氧六環，加入12 μl三丁胺9.27 mg(0.05 mmo1)，待反應液冷卻到4℃，再加入 7μl氯甲酸異丁酯 6.83 mg(0.05 mmol)，反應液在4℃下繼續攪拌20 min。反應結束后，將混合液滴入10 ml預冷至4℃且攪拌均勻含有45.00 mg(0.001 mmol)OVA的溶液中(水∶二氧六環=1∶1，體積比;pH 9.0～9.5)。加入過程約在15 min左右完成，分別在15 min(pH下降到6.0左右)及1 h(pH在8.0左右)后監控反應的pH值變化，用l mol的NaOH將pH值調到8.5。整個反應時間控制在4.5～5.0 h。反應產物用大量蒸餾水4℃透析3 d，透析液用紫外掃描。

用6-氨基己酸法［8］包被抗原3:先稱取6-氨基己酸 6.56 mg(0.05 mmol)、EDC 7.76 mg(0.05 mmol)、OVA 22.5 mg(0.000 5 mmol)溶于水中，調pH至7.5，室溫暗中反應18 h后，用SephadexG-10純化，冷凍，干燥保存。將上述樣品溶于含20%DMF的水中，另稱PBA 10.7 mg(0.05 mmol)溶于DMF中，慢慢滴加入到上述樣品液，然后再加入溶于DMF的DCC 10.3 mg(0.05 mmol)，使DMF最終濃度為30%(體積比)，室溫暗中反應18 h，混合物過濾除沉淀后用大量蒸餾水4℃透析3 d，透析液用紫外掃描儀掃描。

1.4 最佳工作條件的確定

采用方陣滴定法確定3種包被抗原和抗體的最佳工作濃度。選擇吸光值在1.0左右的抗原抗體稀釋濃度作為抗血清及包被抗原工作濃度［12］。設定抗原 濃 度 為 8.000 μg/ml、4.000 μg/ml、2.000 μg/ml、1.000 μg/ml、0.500 μg/ml、0.250 μg/ml、0.125μg/ml等濃度梯度，抗體從1∶2 000開始做倍比稀釋，用間接非競爭ELISA測定最優工作條件。

1.5 包被抗原的優化

在最優工作條件下用間接競爭ELISA(ICELISA)測定3種包被抗原對各種菊酯農藥的抑制情況。以包被抗原1、2、3分別包被ELISA板，每孔100μl，4℃靜置過夜，次日用PBS洗板3次，加入1%OVA(質量體積比)，每孔200μl，37℃封閉1 h，PBST洗板3次，加入抗血清和不同濃度PBA及農藥標準品各50μl，37℃孵育1 h，PBST洗板3次，加入1∶5 000稀釋的二抗，每孔100μl，37℃作用1 h，PBST洗板3次，加入 TMB底物，每孔100 μl，37 ℃ 反應 15 min，2 mol/L 硫酸終止反應，每孔50μl，測定450 nm處吸光值。

1.6 抗原抗體預反應

由于包被抗原和半抗原與抗體的結合能力不同，一般認為大分子的偶聯物抗原會優先與抗體發生結合反應，所以須將抗體和半抗原預先混合，使半抗原與抗體充分結合后剩余的抗體再與包被抗原反應，以達到檢測的準確性［12-13］。考慮到現場快速檢測的要求，針對抗原抗體預先混合反應的必要性做出驗證，設置兩組試驗，一組將 PBA標準品從10μg/ml做系列倍比稀釋，然后分別和最優工作條件下的抗體等體積混合，室溫過夜。另一組則不預混，按照正常IC-ELISA程序進行，觀測兩組吸光值的變化。

1.7 抗原抗體反應時間的優化

對于現場快速檢測來說，縮短檢測時間是非常重要的，故針對抗原抗體反應時間做優化試驗。分別設置抗原抗體反應時間為 30 min、45 min、60 min、90 min，按照IC-ELISA方法進行測定，根據450 nm下的吸光值讀數計算不同抗原抗體反應時間下的抑制中濃度。

1.8 樣品前處理［13］

取大白菜樣品可食部分，用干凈紗布輕輕擦去樣品表面的附著物，切碎后放入食品加工器粉碎，混勻，制成待測樣，備用。準確稱取20.00 g樣品放入打漿瓶中，添加農藥標品，加入40.00 ml乙腈，高速勻漿1 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有7.00 g氯化鈉的50 ml具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，室溫下靜置10 min，使乙腈相和水相分層。準確吸取10 ml乙腈相溶液，加到10 ml試管中，用氮吹儀蒸發至干。用甲醇定容，按照試驗所需濃度稀釋后直接用于ELISA免疫分析測定。

1.9 半定量ELISA應用檢測

根據國家標準，這幾種菊酯農藥在大白菜中的農藥限量分別為氟氰戊菊酯0.5 mg/kg、高效氯氰菊酯2.0 mg/kg、氯氰菊酯2.0 mg/kg、氯菊酯1.0 mg/kg、氰戊菊酯3.0 mg/kg，以此作為試驗中各種農藥的檢測超標限，分別作樣品空白對照孔和超標對照孔。結果判斷標準:①若樣品平均吸光值≥空白對照孔吸光值，則待測樣中不含農藥;②若超標對照孔吸光值＜待測樣品平均吸光值＜空白對照孔吸光值，則待測樣中含有農藥但未超過限量標準;③若待測樣品平均吸光值≤超標對照孔吸光值，則待測樣中有農藥超標［7］。

取大白菜添加不同劑量的農藥樣品，添加按前文所述的提取方法，用IC-ELISA對樣本進行測定。

2 結果

2.1 包被抗原的紫外鑒定

由圖1可以看出，3種方法合成的PBA-OVA的紫外吸收圖譜與OVA、PBA相比，吸收曲線發生了明顯的改變，3種PBA-OVA在PBA的最大吸收峰296 nm處吸光值都有不同程度的增加，表明3種包被抗原PBA-OVA的偶聯是成功的。

2.2 包被抗原的優化

圖1 PBA、OVA、包被抗原的紫外掃描圖譜Fig.1 UV scanning spectra of PBA，OVA and three different coating antigens

方正滴定法確定3種包被抗原的最優工作條件分別是:6-氨基己酸法，抗體稀釋倍數1∶32 000，包被抗原濃度0.250μg/ml;活性酯法，抗體稀釋倍數1∶30 000，包被抗原濃度1.000μg/ml;混合酸酐法，抗體稀釋倍數1∶12 000，包被抗原濃度2.000 μg/ml。

由圖2可以看出，3種不同方法合成的包被抗原在各自的最優工作條件下對PBA和幾種擬除蟲菊酯類農藥的標準品的抑制作用有差異，其中用6-氨基己酸法合成的包被抗原的效果最好，且所用的抗體濃度和包被抗原濃度均是3種包被抗原中最小。這可能是免疫原用的是活性酯法合成的免疫抗原，所以用活性酯法合成包被抗原檢測時抗體中針對偶聯手臂結構的較多，特異性識別半抗原能力相對變弱;而混合酸酐法是讓PBA的羧基形成混合酸酐作為中間體和蛋白質的氨基相連接，雖然是不同的連接方式，但是從紫外圖譜可以看出，此偶聯物在PBA的特征吸收波長296 nm處吸收值較低，可能是偶聯比率太小導致對半抗原識別能力太差。而6-氨基己酸法是用一種新途徑合成了一個六碳連接橋，有效避免了對相同手臂的識別，以提高對農藥的識別靈敏性，這與駱愛蘭等［9］的研究結果相一致。因此選擇此種包被抗原用于下一步試驗。

圖2 不同包被抗原對擬除蟲菊酯農藥IC-ELISA檢測的影響Fig.2 Effects of different coating antigens on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

2.3 抗原抗體預反應方式優化

由圖3可以看出，抗原抗體提前過夜預混與不預混相比，吸光值有相應降低，這可能是抗體在室溫放置過夜后活性有些許下降。而兩種方式都呈現相同的趨勢，并無很大差異，可能是半抗原抗體分子與抗體的反應是在液相中，較固相載體上連接的包被抗原有更充分的接觸面積，所以會較快地與抗體結合。所以并不需要經行提前過夜預混處理，這樣不僅保持了抗體的活性，而且大大節約了時間成本，更符合現場快速檢測的要求。

圖3 不同抗原抗體反應方式對擬除蟲菊酯農藥IC-ELISA檢測的影響Fig.3 Effect of antigen-antibody premixing on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

2.4 抗原抗體反應時間的優化

由圖4可以看出，隨著抗原抗體反應時間的延長，抑制中濃度有小幅度的下降，從30 min的6.95 μg/ml下降至90 min的5.46μg/ml，即隨著反應時間的延長，抗體和抗原的的結合力度更完全更充分。但是對于現場快速檢測來說，節約時間是關鍵，所以選擇45 min作為最優反應時間，這樣可以達到相對較低的抑制中濃度6.30μg/ml和節約時間的雙重效果。

2.5 大白菜基質對于IC-ELISA的影響

選取氟氰戊菊酯作為對象，從圖5中可以看出，大白菜基質對IC-ELISA有一定的影響，主要表現為吸光值有一定的下降，但是抗體和氟氰戊菊酯相互作用的趨勢卻大致類似，所以并不影響半定量ELISA的檢測。因此，所用的前處理方法是適用于大白菜的實際快速粗篩的。

2.6 大白菜中幾種擬除蟲菊酯農藥殘留半定量快速 ELISA 篩選［14］

圖4 不同抗原抗體反應時間對擬除蟲菊酯農藥IC-ELISA檢測的影響Fig.4 Effect of antigen-antibody reaction time on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

圖5 大白菜基質對擬除蟲菊酯農藥IC-ELISA檢測的影響Fig.5 Effect of Chinese cabbage on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

共選取5種擬除蟲菊酯類農藥，分別添加不同的量:0.1 mg/kg、1.0 mg/kg、10.0 mg/kg。每組水平做3個樣。同時空白樣和各類農藥的超標限濃度每一個做10份，取其平均值作為判定標準。考慮到在實際使用農藥的時候，可能將不同的農藥混合使用，所以選擇了高效氯氰菊酯和氯氰菊酯等量混合，以驗證農藥是否有疊加效應。

由表1可以看出，一共檢測了54份大白菜樣品，其中假陽性5份，假陰性1份，假陽性率為7.41%，假陰性率為1.85%。對于添加混合菊酯農藥的大白菜樣品，經過檢測后發現有一定的疊加效應，原因是抗體能夠識別多種農藥，所以在單一農藥有限時，多余的抗體會和另一農藥結合，但是這個不是簡單的相加疊加效應，因為抗體對不同種類的擬除蟲菊酯農藥的親和力不同，具體還有待于進一步驗證。總的來說作為粗篩方法，可以允許一定的假陽性結果出現，但是假陰性應盡量避免。檢測氰戊菊酯時出現了假陰性現象，但在蔬菜中氰戊菊酯超標的情況很少，因此該方法可以適用于大白菜菊酯 農藥類實際快速粗篩的檢測需求。

表1 半定量ELISA檢測大白菜中幾種擬除蟲菊酯類農藥結果Table 1 The pyrethroid pesticide residues in Chinese cabbage detected by semi-quantitative ELISA

3 討論

ELISA免疫檢測方法具有操作簡單、不需復雜的樣品前處理、需樣量少、通量大的特點，目前已有大量的研究報告，但實際應用很少，除了該技術自身存在一些不足，如準確性不如儀器法，重現性太差等，作者認為該技術的定量要求較高也是一個重要原因。作為粗篩方法，半定量ELISA的判定標準是一種簡單實用的方法，超標樣品可以用儀器法進一步分析。從本試驗中對大白菜樣品的半定量ELISA的檢測結果可以看出，該方法可以同時滿足幾種擬除蟲菊酯類農藥的超標初篩，假陽性率很低，能有效防止漏篩;氟氰戊菊酯檢測結果出現了假陰性，可能是因為半定量的準確性較低。考慮到實際施藥情況的復雜性，對于單個不超標的幾種農藥混合的情況，可能會判定為陽性結果。因此本試驗建立的半定量ELISA檢測方法對于大白菜中幾種擬除蟲菊酯類農藥檢測具有可行性。

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