利用RIP-Chip篩選結合多聚胞嘧啶結合蛋白2的microRNAs

韓 為，林細華，陰 彬，彭小忠

(中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院生物化學與分子生物學系醫學分子生物學國家重點實驗室，北京100005)

多聚胞嘧啶結合蛋白2(PCBP2)是對多聚胞嘧啶［Poly(C)］具有高度親和性的RNA 結合蛋白，在胞核和胞質中穿梭表達［1］。通過對核心識別位點“ACCC”和“CCCU”的特異性結合［2］，PCBP2 參與到靶mRNA的穩定性，選擇性剪接和翻譯調節［3］。近年來，有研究人員注意到microRNA(miRNA)也可以直接結合PCBP2 蛋白，通過“誘騙”機制干擾PCBP2 對靶mRNA的調控作用［4］。PCBP2 還可以與Dicer 酶相互作用，調節miRNA 生成［5］。本實驗室在前期工作中發現PCBP2 在人神經膠質瘤細胞中高表達。本研究通過核糖核蛋白免疫沉淀-芯片技術(RIP-Chip)在人正常神經膠質細胞(HA)和神經膠質瘤細胞(T98G 和U87MG)中篩選與(PCBP2)相互作用的miRNA。

1 材料與方法

1.1 材料

HA 細胞和AM 培養基(ScienCell 公司)，T98G和U87MG 細胞(美國模式培養物集存庫ATCC)，MEM/EBSS 和胎牛血清(Gibco 公司)，β-actin 抗體(Sigma 公司)，正常兔IgG、兔抗人PCBP2 抗體和RIP-Assay Kit for microRNA(MBL 公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自(北京中杉金橋生物技術有限公司)，ECL Western blot 發光檢測試劑、蛋白酶抑制劑、糖原和Protein A Agarose 瓊脂糖(Roche 公司)，RNA 酶抑制劑和DTT［寶生物工程(大連)有限公司］。

1.2 細胞培養

人正常星形膠質細胞HA 培養于含2%胎牛血清的AM 培養基中，人神經膠質瘤細胞T98G 和U87MG 培養于含10%胎牛血清的MEM 培養基中。所有細胞置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，按1∶2細胞每2 ～3 d 傳代1 次。

1.3 Western blot 檢測

收集3 種細胞系或這3 種細胞的RIP 蛋白樣品，98 ℃ 10 min 變性后－ 20 ℃保存。樣品經10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離約2 h 后，半干轉法轉移至硝酸纖維素膜上，5%高蛋白脫脂奶粉封閉30 min。按相應比例封閉一抗，室溫搖床孵育3 h，TBST 漂洗10 min ×3 次，與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫搖床孵育1.5 h，TBST 漂洗10 min ×3次，ECL 顯色。……