番茄micro-TOM活體再生體系的建立

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧省植物基因工程技術(shù)研究中心，遼寧沈陽110866）

番茄micro-TOM活體再生體系的建立

曹慧穎 王玉瑩 孫建坤 劉玲莉 張立軍 阮燕曄 夏潤璽*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧省植物基因工程技術(shù)研究中心，遼寧沈陽110866）

番茄micro-TOM是生物學(xué)研究的模式植物，它的離體再生體系對遺傳轉(zhuǎn)化及發(fā)育生物學(xué)研究至關(guān)重要。但是micro-TOM組培再生體系費(fèi)時費(fèi)力，容易污染。本試驗(yàn)通過對活體植株進(jìn)行去頭去腋芽誘導(dǎo)，建立了高效快捷、不依賴外源激素的番茄micro-TOM活體再生體系，為簡化番茄遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，也為植物再生機(jī)理研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。

植物再生；組織培養(yǎng)；再生機(jī)理；遺傳轉(zhuǎn)化；番茄micro-TOM

植物離體再生體系不僅是獲得大量無性繁殖植物和進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的重要途徑，而且亦是研究植物發(fā)育問題的主要實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)之一（關(guān)春梅和張憲省，2006）。番茄micro-TOM是一種番茄突變體，它保留了普通番茄作為模式植物的基本特征，但植株矮小，生命周期更短，具有節(jié)省研究空間、縮短研究時間的巨大優(yōu)勢，因此番茄micro-TOM比普通番茄更適合應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究（劉小花 等，2008）。功能基因組學(xué)研究經(jīng)常與遺傳轉(zhuǎn)化相結(jié)合，但是micro-TOM組培再生費(fèi)時費(fèi)力，容易污染。本試驗(yàn)建立了一種不需要組織培養(yǎng)的活體再生體系，為簡化番茄遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)；同時活體再生不需要外源激素，也為植物再生機(jī)理的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄（Solanum lycopersicum L.）micro-TOM種子購自南京市豐泰園藝種業(yè)有限公司。

1.2 番茄活體再生的誘導(dǎo)

將番茄種子催芽后入土，待幼苗3～4片葉時移栽入盆，培養(yǎng)室溫度控制在23～28℃，16 h光照。選取健康番茄植株，水平去頭，并剔除腋芽，隨后的管理中要及時去除肉眼可見腋芽。

1.3 番茄離體再生的誘導(dǎo)

番茄種子消毒后接種于MS培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)箱中光照16 h，培養(yǎng)7 d獲得無菌苗。取子葉完全展開、但真葉還未出現(xiàn)的無菌苗，將子葉切成0.5 cm的小段作為外植體，置于含有1μg·mL-1玉米素的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織及再生芽。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄micro-TOM的活體再生

番茄micro-TOM植株發(fā)育到6～8片葉時，只有主枝具有頂端生長點(diǎn)，其他的腋芽極少萌發(fā)。頂端生長點(diǎn)去除后（圖1-A），葉腋處的腋芽迅速萌發(fā)，頂端傷口表面形成一薄層白色硬皮。隨著肉眼可見的新生腋芽的剔除，頂端傷口白色部分逐漸縮小，露出稚嫩綠色，綠色部分逐漸隆起形成明顯的愈傷組織（圖1-B），隨后愈傷組織表面分化出大量紫色小點(diǎn)，最終分化形成多個再生芽（圖1-C，D）。

在植物發(fā)育研究實(shí)驗(yàn)室歷時4 a的番茄活體再生實(shí)踐中，大部分去頭的主枝傷口都可以成功再生，只有極個別的植株在受到如此嚴(yán)重的生長脅迫后發(fā)育停滯。主枝傷口再生叢生芽的同時，許多剔除腋芽的傷口也會萌發(fā)叢生芽。而且最初去頭去腋芽的時間無論是在番茄的營養(yǎng)生長時期，還是在已經(jīng)開花的生殖生長時期，均可以實(shí)現(xiàn)活體再生，但幼嫩植株的再生能力要高于較老的植株。

圖1 番茄micro-TOM的活體再生

2.2 番茄micro-TOM活體再生與離體再生的比較

番茄的離體再生體系通常以子葉或下胚軸為外植體，在外源激素的誘導(dǎo)下，傷口表面首先形成愈傷組織，愈傷組織繼而分化叢生芽（曹慧穎 等，2012）。番茄micro-TOM的離體再生過程如圖2所示，此過程與活體再生過程相同，先是傷口形成愈傷組織，進(jìn)而分化叢生芽。但是兩個發(fā)育過程所需時間卻不相同，活體再生愈傷組織形成需要12 d，分化再生芽需要23 d，所需時間明顯少于離體再生愈傷組織形成時間（22 d）和分化再生芽時間（25 d）（愈傷組織的形成和分化是一個連續(xù)的過程，這里所指的時間是指形成圖1和圖2所示愈傷組織和再生芽需要的時間），而且活體再生不會發(fā)生微生物污染、褐化等問題。

圖2 番茄micro-TOM的組織培養(yǎng)

對于兩個再生體系的繁殖能力，筆者分別調(diào)查了同一批次的培養(yǎng)物中，生長最快的8個個體，芽長大于1.5 cm的再生芽個數(shù)活體再生的平均為3.625個，離體再生的為2.125個。但是再生芽在愈傷組織上的發(fā)生是源源不斷的，如果將已經(jīng)長成的芽移除，還會有新的芽長大，所以這個結(jié)果并不能說明活體再生的繁殖系數(shù)高，只能說明在短時間內(nèi)會得到較多的再生芽。

2.3 番茄micro-TOM活體再生過程中葉片變化

當(dāng)番茄micro-TOM植株去頭去腋芽后，葉腋處的潛伏芽迅速萌發(fā)，隨著新生腋芽的逐漸剔除，番茄葉片逐漸變成墨綠色。這種變化可能是番茄受到生長脅迫后發(fā)生的一種適應(yīng)性變化。當(dāng)再生苗長出新葉后，葉片顏色、形態(tài)完全正常。將再生苗從老的植株上切除，插入水中即可自然生根，長成一株完整的植株。

3 討論

番茄的再生體系在基因工程領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用（王水琦 等，2007；Ehlert et al.，2008；Van et al.，2010），但是這種再生體系僅限于離體再生。離體再生需要根據(jù)不同的番茄基因型逐一摸索組織培養(yǎng)條件，這項(xiàng)工作費(fèi)時費(fèi)力，時常受到微生物污染的困擾。本試驗(yàn)建立了番茄micro-TOM的活體再生體系，這個體系只需要簡單的去頭、去腋芽處理，完全不需要外源激素，不受基因型的干擾，簡便易行，大大簡化了番茄再生的方法。

番茄的遺傳轉(zhuǎn)化通常由農(nóng)桿菌侵染外植體傷口細(xì)胞（曹慧穎和郭三堆，2005；曹慧穎 等，2009），然后借助組織培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化苗。對于活體再生體系，也是由植物的傷口產(chǎn)生愈傷組織，進(jìn)而萌發(fā)叢生芽，那么是否可以嘗試將農(nóng)桿菌涂布于植物傷口，然后將抗生素滴加于傷口表面進(jìn)行抗性篩選，待傷口表面萌發(fā)再生芽后，再進(jìn)行分子檢測。該番茄遺傳轉(zhuǎn)化方案，不需要組織培養(yǎng)，如試驗(yàn)成功，將大大簡化遺傳轉(zhuǎn)化工作流程。

植物離體再生由于取材容易，培養(yǎng)條件容易控制，所以一直是植物再生機(jī)理研究的理想試材。但是Yin等（2008）在4種不同激素組合誘導(dǎo)水稻愈傷組織分化過程中鑒定出了157種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，說明不同激素可以誘導(dǎo)同種外植體再生，但是再生過程的基因表達(dá)譜卻差異很大。

植物生長過程中受到干旱、冷害、鹽、重金屬脅迫時，植物內(nèi)源激素也會發(fā)生相應(yīng)的變化（Xiong et al.，2002；朱延姝和馮輝，2005）；而且組織培養(yǎng)再生中，外源激素的誘導(dǎo)起到了決定性的作用（葉興國 等，2012）；同時Tezuka等（2011）報道在番茄去頭傷口上施加激素對活體再生具有促進(jìn)作用。據(jù)此筆者推測在活體再生中內(nèi)源激素含量可能也相應(yīng)地發(fā)生了變化，而且這種激素變化完全是由植物自身調(diào)控的，因此番茄活體再生體系是研究植物再生機(jī)理的一個良好材料。

曹慧穎，郭三堆．2005．人乳鐵蛋白基因在番茄中的優(yōu)化表達(dá)．園藝學(xué)報，32 （6）：1030-1033.

曹慧穎，張銳，郭三堆．2009．串聯(lián)的人胸腺素α1 基因在番茄中的高效表達(dá)．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，42 （7）：2291-2296.

曹慧穎，張立軍，夏潤璽，高嵩，王思，張少斌．2012．番茄組織培養(yǎng)研究進(jìn)展．中國蔬菜，（16）：1-6.

關(guān)春梅，張憲省．2006．植物離體器官發(fā)生控制機(jī)理研究進(jìn)展．植物學(xué)通報，23 （5）：595-602.

劉小花，張嵐嵐，朱長青，陳昆松，徐昌杰．2008．Micro-Tom番茄矮化微型機(jī)制及其在植物功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用．遺傳，30 （10）：1257-1264.

王水琦，陳堅，林忠平．2007．超敏反應(yīng)輔助蛋白基因 （hrap） 轉(zhuǎn)化番茄的研究．園藝學(xué)報，34 （2）：377-380.

葉興國，佘茂云，王軻，杜麗璞，徐惠君．2012．植物組織培養(yǎng)再生相關(guān)基因鑒定、克隆和應(yīng)用研究進(jìn)展．作物學(xué)報，38 （2）：191-201.

朱延姝，馮輝．2005．弱光脅迫下番茄苗期功能葉片內(nèi)源激素含量的變化．東北師大學(xué)報：自然科學(xué)版，37 （3）：77-80.

Ehlert B，Schottler M A，Tischendorf G，Ludwig-Muller J，Bock R．2008．The paramutated SULFUREA locus of tomato is involved in auxin biosynthesis．J Exp Bot，59 （13）：3635-3647.

Van D T，F(xiàn)erro N，Jacobsen H J．2010．Development of a simple and effective protocol for Agrobacterium tumefaciens mediated leaf disc transformation of commercial tomato cultivars．GM Crops，1 （5）：312-321.

Xiong L，Schumaker K S，Zhu J K．2002．Cell signaling during cold，drought，and salt stress．The Plant Cell，（s）：165-183.

Yin L，Lan Y，Zhu L．2008．Analysis of the protein expression profiling during rice callus differentiation under different plant hormone conditions．Plant Mol Biol，68 （6）：597-617.

Tezuka T，Harada M，Johkan M，Yamasaki S，Tanaka H，Oda M．2011．Effects of auxin and cytokinin on in vivo adventitious shoot regeneration from decapitated tomato plants．HortScience，46 （12）：1661-1665．

Establishment of Tomato micro-TOM Regeneration System in Vivo

CAO Hui-ying， WANG Yu-ying， SUN Jian-kun， LIU Ling-li， ZHANG Li-jun， Ruan Yan-ye， XIA Run-xi*

（College of Biological Science and Biotechnology，Shenyang Agricultural University，Liaoning Provincial Research Center of Plant Gene Engineering Technology， Shenyang 110866， Liaoning，China）

Tomato （Solanum lycopersicum L.）micro-TOM is a model organism for biology study. Its regeneration system in vitro is of vital importance for genetic transformation and developmental biology study. But tomato micro-TOM tissue culture is not only time-consuming and tedious， but also frequently polluted by microorganism. This experiment introduces a new method of regeneration system in vivo by removing axillary and apical buds of tomato. The method has high speed and efficiency， and does not rely on exogenous hormone. It has layed a foundation for simplifying tomato genetic transformation and provided a good material for plant regeneration mechanism study.

Plant regeneration； Tissue culture； Regeneration mechanism； Genetic transformation ；Tomato micro-TOM

曹慧穎，女，博士，講師，專業(yè)方向：植物分子生理，E-mail：497110804@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：夏潤璽，講師，專業(yè)方向：植物基因工程，E-mail：xiarunxi@163.com

2014-07-16；接受日期：2014-11-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31300164），教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20122103120004），沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新資助項(xiàng)目