煙草種子攜帶病原真菌的分離與鑒定

汪漢成，黃艷飛，王 進，王茂勝，商勝華，葉定勇，龍明錦

（1.貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；2.長江大學農學院，湖北 荊州 434025；3.長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025）

煙草種子攜帶病原真菌的分離與鑒定

汪漢成1*，黃艷飛2*，王 進3，王茂勝1，商勝華1，葉定勇1，龍明錦1

（1.貴州省煙草科學研究院，貴陽 550081；2.長江大學農學院，湖北 荊州 434025；3.長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025）

采用無菌濾紙培養煙苗的方法對貴州主栽的 4 個烤煙品種裸種進行了帶菌檢測，并對種子攜帶真菌進行了分離與鑒定。結果表明，K326、貴煙 4 號、韭菜坪 2 號和南江 3 號的種子帶菌率分別為 15%、77.78%、21.67%和 61.39%。分離和鑒定發現種子攜帶的真菌有鏈格孢菌屬（Alternaria sp.）、擬莖點霉屬（Phomopsis sp.）、支頂孢屬（Acremonium sp.）、柄孢殼屬（Zopfiella sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮孢菌屬（Fusarium sp.）、青霉菌屬（Penicillium sp.）、赤霉菌屬（Gibberella sp.）、芽枝孢菌屬（Cladosporium sp.）、離蠕孢屬（Bipolaris sp.）和 Stagonosporopsis cucurbitacearum 等。獲得 40 株真菌中共有22種真菌，優勢菌群主要為鏈格孢屬、芽枝孢菌屬、鐮孢菌屬和赤霉菌屬。鏈格孢菌屬在 4個烤煙品種上均有發現。鐮孢菌屬主要來自于貴煙4號、韭菜坪2號和南江3號，其中南江3號種子上最多。芽枝孢菌屬僅來自貴煙4號。貴煙4號和南江3號種子上的真菌種類和數量較多。這些種子攜帶真菌的發現對烤煙種子的生產與加工具有重要的意義。

煙草種子；病原菌；分離；鑒定

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經濟作物，其產量占全球煙草產量的 39.6%[1]。隨著栽培條件的變化，煙草病蟲害的危害日益嚴重，造成的經濟損失巨大。據不完全統計，我國每年煙草病害造成的直接經濟損失在 7 億元以上[2]。煙草病害的發生存在于煙草生長的各個時期，其中，由煙草種子為載體或媒介傳播、侵染新生煙株引起的煙株局部或整體發生的病害稱為煙草種傳病害[3]。煙草種子是傳播煙草病原菌最主要的途徑之一。種傳病原菌通常存在于種子表面或內部，或以各種病殘體直接或間接混雜于種子之間。這些病原菌往往是煙草病害的初次浸染來源。據報道種子傳播引起的煙草真菌性病害有煙草炭疽病、煙草赤星病、煙草霜霉病和煙草低頭黑病等。這些病害均可導致苗期和大田期煙草病害的大量發生[4]，對煙草的生產造成嚴重損失。

從源頭上發現煙草種傳病原真菌，對其進行分離、鑒定以及病原菌生物學習性的研究，開展種子消毒技術研究和研發新型種衣劑是提高煙草抗病能力的關鍵。然而，煙草種子的加工和處理都是建立在對煙草種傳病原菌研究的基礎之上。本研究以貴州省煙草良繁烤煙良種 K326、貴陽 4 號、韭坪 2號和南江3號的裸種為材料，對烤煙種子真菌性病害帶病率進行檢測，并進行病原菌的分離與鑒定及多樣性分析，旨在為煙草種子的加工處理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 烤煙種子和培養基

供試烤煙品種為 K326、貴煙 4 號、韭菜坪 2號和南江3號，所有裸種均由貴州省煙草科學研究院良繁中心提供，每品種 360 粒。種子病原真菌的分離采用 PDA 培養基[5]，于 2013 年 8 月在貴州省煙草科學研究院微生物實驗室進行。

1.2 種子真菌性病害帶菌率檢測

參照培養皿小苗法[6]，將供試烤煙種子作不消毒處理，按 6×6 方陣排列，均勻地播種于盛有用無菌水保濕濾紙的無菌平板（直徑 9 cm）中，置于28 ℃恒溫培養箱中，在每天交替光照、黑暗各 12 h下培養 12 d，檢查和記錄烤煙種子真菌性病害帶菌情況。

1.3 種子真菌性病害病原菌的分離

無菌條件下制備 PDA 平板。上述種子經 12 d培養后形成帶病情況不同的煙苗，選取帶有不同形態、顏色和生長速度菌落的病原菌煙苗，挑取少量菌絲或者孢子至于 PDA 平板，于 28 ℃黑暗條件下培養，6 d 后對長出的菌落進行純化，將純化的病原菌至于盛有 15%無菌甘油的菌種保存管中，于-20 ℃長期保存、備用。

1.4 種子真菌性病害病原菌的鑒定

將分離到的各種病原菌轉移到 PDA 培養基進行培養，挑取各種病原菌的菌絲和孢子于顯微鏡下進行形態學鑒定。同時，利用寶生物工程（大連）有限公司的真菌基因組 DNA 提取試劑盒（TaKaRa Code: D304）提取各種病原菌的基因組 DNA。利用真菌核糖體基因轉錄間隔區（ITS）通用引物 ITS1（ 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對病原菌的rDNA-ITS 區進行 PCR 擴增[7]。擴增條件為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 1 min，57 ℃退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，共 30 個循環；最終 72 ℃延伸10 min。采用 1.0%瓊脂糖電泳檢測 PCR 產物，并送上海生工測序公司測序。測序結果在 GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫中進行 BLAST 對比分析。采用分子生物學鑒定結果對各種病原菌進行鑒定，并在 NCBI數據庫中登錄各病原菌的基因序列信息。

2 結 果

2.1 烤煙種子真菌性病害帶菌率檢測

烤煙種子真菌性病害對種子和煙苗的危害如圖1所示。烤煙種子在被病原真菌侵染后，主要表現為煙苗被真菌侵染，繼而死亡。K326、貴煙 4 號、韭菜坪2號和南江3號的種子真菌性病害帶菌率各不相同，結果如表1 所示，其帶菌率分別為 15%、77.78%、21.67%和 61.39%。

2.2 烤煙種子病原真菌的鑒定

圖1 4 種烤煙種子真菌性病害帶菌率檢測Fig. 1 Fungal pathogens testing from the seeds of four tobacco cultivars

表1 不同烤煙品種真菌性病害帶菌率檢測Table 1 Fungal pathogens testing from the seeds of different tobacco cultivars

隨機挑取危害癥狀和菌落形態相同的病原真菌進行分離和鑒定，鑒定結果如表2所示。從烤煙K326 上共分離到 3 種病原真菌，其優勢病原菌為鏈格孢屬（Alternaria sp.），所占比例為 66.67%。從貴煙4號上共分離到9種病原真菌，其中優勢病原菌為支孢樣支孢霉（Cladosporium cladosporioides）和鏈格孢屬，其占比例分別為 45.45%和 13.6%。從烤煙韭菜坪2號上共分離到5種病原真菌，其中優勢病原菌為鏈格孢屬，其占比例為 60%。從南江 3號上共分離到 10 種病原真菌，其中優勢病原菌為鐮孢菌屬（Fusarium sp.）和赤霉菌屬（Gibberella sp.）。其所占比例分別為 40%和 30%。

鑒定結果表明，煙草種子真菌性病害病原菌較多（表2），病原菌主要分布于鏈格孢菌屬（Alternaria sp.）、 擬 莖 點 霉 屬 （Phomopsis sp.）、 支 頂 孢 屬（Acremonium sp.）、柄孢殼屬（Zopfiella sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮孢菌屬（Fusarium sp.）、青霉菌屬（Penicillium sp.）、赤霉菌屬（Gibberella sp.）、芽枝孢菌屬（Cladosporium sp.）、離蠕孢屬（Bipolaris sp.）和 Stagonosporopsis cucurbitacearum等。40 株病原真菌中，共有 22 種病原真菌（表3）；其中，芽枝孢菌屬和鏈格孢菌屬數量最多，均為 10株。芽枝孢菌屬僅分布于貴煙4號，鏈格孢菌屬在4種烤煙品種上均有發現。鐮孢菌屬共有6株，主要分布于貴煙4號、韭菜坪2號和南江3號，其中南江3號種子上最多（4株）。

表2 烤煙種子病原真菌鑒定Table 2 Pathogens identification from the seeds of flue-cured tobacco

表3 烤煙種子病原真菌分布情況Table 3 Pathogens distribution from the seeds of flue-cured tobacco

3 討 論

本研究以烤煙裸種為材料，采用無菌濾紙培養煙苗的方式來檢測煙草種子攜帶的真菌，可較好地檢測煙草種子真菌帶菌狀況；采用 PDA 培養基對種子病原真菌進行分離和培養，可以很好的獲得煙草種子病原真菌。這種方法簡便、高效、重現性高，可推薦作為貴州及全國煙草種子健康檢測的標準方法之一。

近年來煙草苗期和大田期病害危害日益嚴重[8-9]，對種子病原菌的研究也逐漸受到重視。譚仲夏等[10]對云南省 8 個煙草種子生產基地的煙草種子進行了帶菌檢測和分離鑒定，發現煙草種子攜帶的病原真菌有鏈格孢、鐮孢菌、腐霉和芽枝孢菌，樣品檢出率高達 87.5%；其中，優勢菌群為鏈格孢。華致甫等[11]發現煙草種子上帶有煙草赤星病菌、煙草野火病菌和鐮孢菌等，病原菌檢出率為 8%～18%；發現赤星病菌和野火病菌同時存在于種子表面、種皮內部和胚乳上。本研究從貴州省烤煙良繁種子上也分離到了鏈格孢屬、芽枝孢菌屬和鐮孢菌屬優勢病原真菌，與前人報道有共同之處[12]。進一步說明這3種病原真菌在烤煙種子上出現的頻率較高，是烤煙種子生產上值得關注的病原菌。此外，本研究還在烤煙種子上發現了支頂孢屬、柄孢殼屬、曲霉屬、青霉菌屬、平臍蠕孢屬和擬莖點霉屬病原菌，研究結果進一步豐富了烤煙種子病原真菌的內涵[13-14]。鏈格孢菌是引起煙草主要葉斑病害—赤星病的病原，煙草種子檢測出該菌可能與煙草種子成熟期煙草赤星病的大規模流行有關。因此，在煙草種子田間生產過程中應加強對赤星病的防治以減少煙草種子鏈格孢的攜帶量。此外，煙草種子攜帶芽枝孢菌、鐮孢菌、支頂孢等，而這些真菌并不是煙草葉部病害的病原菌。它們可能來自于其他作物，通過氣流在煙草花絮或蒴果上定殖，也可能在種子晾曬過程中傳入；對于這些病原真菌的來源開展研究，可以從源頭上減少煙草種子的帶菌量。

4 結 論

本研究檢測的 K326、貴煙 4 號、韭菜坪 2 號和南江 3 號的種子帶菌率分別為 15%、77.78%、21.67%和 61.39 %。分離和鑒定發現種子攜帶的真菌 有 鏈 格 孢 菌 屬 （ Alternaria sp.）、 擬 莖 點 霉 屬（Phomopsis sp.）、支頂孢屬（Acremonium sp.）、柄孢殼屬（Zopfiella sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、鐮孢菌屬（Fusarium sp.）、青霉菌屬（Penicillium sp.）、 赤 霉 菌 屬 （Gibberella sp.）、 芽 枝 孢 菌 屬（Cladosporium sp.）、離蠕孢屬（Bipolaris sp.）和Stagonosporopsis cucurbitacearum 等。獲得 40 株真菌中共有 22 種真菌，優勢菌群主要為鏈格孢屬、芽枝孢菌屬、鐮孢菌屬和赤霉菌屬。鏈格孢菌屬在4個烤煙品種上均有發現。鐮孢菌屬主要來自于貴煙4號、韭菜坪2號和南江3號，其中南江3號種子上最多。芽枝孢菌屬僅來自貴煙4號。貴煙4號和南江3號種子上的真菌種類和數量較多。這些真菌均會侵染種子或者煙苗，在烤煙種子包衣前很有必要對種子進行消毒處理，以提高烤煙生產用種的種子質量。

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Fungi Isolation and Identification on Tobacco Seeds

WANG Hancheng1*, HUANG Yanfei2*, WANG Jin3, WANG Maosheng1, SHANG Shenghua1, YE Dingyong1, LONG Mingjin1
(1. Guizhou Academy of Tobacco Sciences, Guiyang 550081, China; 2. College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China; 3. College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025, China)

Fungi levels in four tobacco cultivars in Guizhou province were tested on tobacco seedlings that incubated on sterile filter paper. The fungi were isolated and identified. Results showed that fungi levels in K326, Guiyan 4, Jiucaiping 2, and Nanjiang 3 were 15%, 77.78%, 21.67% and 61.39%, respectively. The fungi in those four cultivars included Alternaria sp., Phomopsis sp., Acremonium sp., Zopfiella sp., Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Gibberella sp., Cladosporium sp., Bipolaris sp., and Stagonosporopsis cucurbitacearum. Forty isolates were isolated all together, in between about 22 different fungi. However, Alternaria sp., Cladosporium sp., Fusarium sp. and Gibberella sp. were the dominant fungi. Alternaria sp. were found on all four cultivars; Fusarium sp. were found on Guiyan 4, Jiucaiping 2 and Nanjiang 3, and was dominant on cultivar Nanjing 3. Cladosporium sp. was only found on cultivar Guiyan 4. The number of fungi and number of species were the highest in cultivar Guiyan 4 and Nanjiang 3. Those findings provide important information for tobacco seed production and process.

tobacco seeds; isolation; identification; pathogen

S572.08

1007-5119（2014）05-0084-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.05.016

國家自然科學基金（31360448）；貴州省科學技術基金{黔科合 J 字[2011]2337 號}；中國煙草總公司貴州省公司科技項目（201305，201336，201436）

汪漢成，男，博士，副研究員，主要從事煙草植物保護和微生物學研究。E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com。*同等貢獻作者

2014-04-29

2014-07-22