響應(yīng)面法優(yōu)化β-環(huán)糊精脫除鴨蛋黃油脂膽固醇工藝條件

李 永 陳有亮 任大喜

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

蛋黃油脂是從蛋黃中提取的脂質(zhì)，因提取方法不同成分有較大差異，但含有豐富的卵磷脂、不飽和脂肪酸是其主要特征。具有調(diào)節(jié)血脂，改善神經(jīng)功能等多種生理功能，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域［1］。但因蛋黃膽固醇含量過(guò)高，制取的蛋黃油脂同樣膽固醇含量很高。而攝入高膽固醇食品會(huì)造成血清膽固醇升高，引發(fā)心血管疾病［2］，低膽固醇食品的膳食成為人們的首選。因此，設(shè)法脫除食品中的膽固醇成了研究的熱點(diǎn)。

β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，簡(jiǎn)稱 β-CD）是由7個(gè)吡喃葡萄糖單元以α-（1，4）-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚物，作為食品添加劑廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)［3］，可脫除膽固醇，防止微生物污染和褐變反應(yīng)［4］，保持香味，消除不良?xì)馕叮?］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)生產(chǎn)低膽固醇食品研究主要集中在用膽固醇氧化酶降解，乳酸菌發(fā)酵，β-CD包合以及納濾、萃取、溶劑抽提等物理化學(xué)方法脫除膽固醇［6-7］。然而，與其他脫除膽固醇工藝相比，β-CD包合法具有脫除效率高、工藝簡(jiǎn)單可行的優(yōu)點(diǎn)［8］。

通過(guò)β-CD包合法脫除動(dòng)物性產(chǎn)品中的膽固醇已有大量研究［9-15］。在美國(guó)利用β-CD制造的低膽固醇蛋品早已進(jìn)入市場(chǎng)［16］。在國(guó)內(nèi)β-CD包合法制造低膽固醇蛋黃的研究大部分集中在直接從蛋黃液中脫除膽固醇，結(jié)果會(huì)造成蛋黃中蛋白質(zhì)、磷脂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的部分損失［17］，但是β-CD包合法脫除蛋黃油膽固醇的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了β-CD脫除鴨蛋黃油脂膽固醇。通過(guò)優(yōu)化工藝參數(shù)，提高膽固醇脫除率和油脂回收率，為工業(yè)化生產(chǎn)低膽固醇蛋黃油脂提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-CD：孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司。

TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；721N可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；JHS-1電子恒速攪拌機(jī)：杭州儀表電機(jī)有限公司；SY-6000小型噴霧干燥儀：上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備有限公司；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司。

鴨蛋黃油脂：新鮮鴨蛋黃與水按1∶1.5（體積比）混合，2層紗布過(guò)濾除去系帶、蛋黃膜后，以進(jìn)口溫度165℃，出口溫度82℃，進(jìn)行噴霧干燥制得蛋黃粉。然后將一定質(zhì)量的蛋黃粉與乙酸乙酯按1∶12（m∶V）混勻，35℃回流提取60 min。提取完畢，真空抽濾、取濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，得到鴨蛋黃油脂（主要成分為三酰甘油和膽固醇，其中膽固醇含量為 51.47 mg／g，三酰甘油含量為 948.53 mg／g）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，進(jìn)行試驗(yàn)條件的優(yōu)化。選用五因素五水平中心組合設(shè)計(jì)確定5個(gè)處理因素對(duì)膽固醇脫除率（Y1）和蛋黃油脂回收率（Y2）的影響。基于前期初步試驗(yàn)研究，選取水油比（W∶O）、β-CD與油之比（β-CD∶O）、時(shí)間、溫度、攪拌速度5個(gè)因素。試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1，響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平編碼表

表2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 （續(xù)）

1.2.2 試驗(yàn)步驟

取一定質(zhì)量鴨蛋黃油脂，將不同質(zhì)量濃度的β-CD溶液與蛋黃油脂混勻。在不同的水浴溫度和時(shí)間下，用恒速攪拌機(jī)以不同的攪拌速度攪拌。然后6 000 r／min，5 min離心處理，上清液即為低膽固醇蛋黃油脂。取上清液測(cè)定膽固醇含量，計(jì)算膽固醇脫除率見(jiàn)式（1）；同時(shí)稱量上清液質(zhì)量，計(jì)算蛋黃油脂回收率見(jiàn)式（2）；回收中間層膽固醇-β-CD復(fù)合物。

式中：W1為原蛋黃油脂膽固醇含量／mg／g；W2為上清液膽固醇含量／mg／g。

式中：m1為上清液油脂質(zhì)量／g；m2為原油脂質(zhì)量／g。

1.2.3 膽固醇含量測(cè)定

采用直接皂化法測(cè)膽固醇含量［18］，并做適當(dāng)改進(jìn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6軟件中的Central Composite Design進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立回歸模型及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽固醇脫除率（Y1）響應(yīng)面分析

2.1.1 回歸模型建立及顯著性檢驗(yàn)

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行回歸分析，擬合的膽固醇脫除率（Y1）對(duì) W∶O（X1），β-CD∶O（X2），時(shí)間（X3），溫度（X4），攪拌速度（X5）的二次回歸方程為：

從表3知，失擬檢驗(yàn)不顯著（F1＝2.56，P＝0.102 7），模型合適，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好。方差分析結(jié)果表明二次回歸方程極顯著（P＜0.000 1），同時(shí)也說(shuō)明不必?cái)M合更高次冪的方程。

為了分析各因子對(duì)回歸方程的影響，對(duì)偏回歸系數(shù)進(jìn)行分析（表3），X2、X4對(duì)蛋黃油脂膽固醇脫除率有極顯著影響（P＜0．01），而 X1、X3、X5無(wú)顯著影響（P＞0．05），但是 X1X3、X3X5的交互效應(yīng)對(duì)膽固醇脫除率有顯著影響（P＜0．01）。X12、X5

2也是顯著項(xiàng)（P＜0．01），同時(shí)需要指出的是 X52的二次項(xiàng)的F值比其他項(xiàng)都大，表明攪拌速度的二次回歸效應(yīng)作用最大。

表3 二次回歸方程、偏回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的方差分析

2.1.2 單因子及交互效應(yīng)分析

由表3可知，5個(gè)因素對(duì)膽固醇脫除率（Y1）的影響順序?yàn)椋簻囟?＞β-CD∶O＞時(shí)間 ＞攪拌速度 ＞W(wǎng)∶O。圖1a反應(yīng)了當(dāng)某個(gè)因子變動(dòng)，而其他因子保持不變時(shí)對(duì)膽固醇脫除率的影響［19］。W∶O（A）、時(shí)間（C）、攪拌速度（E）的編碼值增大時(shí)膽固醇脫除率先增大后降低。β-CD∶O（B）在-1～+1的整個(gè)編碼區(qū)內(nèi)變化時(shí)，膽固醇脫除率一直在增大。溫度（D）在編碼區(qū)-1～+1內(nèi)升高時(shí)，膽固醇脫除率呈線性降低；在所有因素中，溫度對(duì)二次回歸方程的直線效應(yīng)最顯著。

圖2a可知，在W∶O的整個(gè)編碼區(qū)內(nèi)，隨攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)，膽固醇脫除率先增大后減小；而攪拌時(shí)間固定某一值后，膽固醇脫除率也隨W∶O增大先增大后減小，說(shuō)明加水必須適量，太多的水反而會(huì)使油脂中膽固醇稀釋，不利于膽固醇與β-CD的接觸形成包合物。只有W∶O和攪拌時(shí)間同時(shí)增大到一定程度時(shí)膽固醇脫除率才能達(dá)到最大，二者的交互效應(yīng)表現(xiàn)為膽固醇脫除率的增大。

圖2b可知，當(dāng)時(shí)間保持不變，隨攪拌速度增大，膽固醇脫除率先增大后減小；在較低轉(zhuǎn)速時(shí)，延長(zhǎng)攪拌時(shí)間，膽固醇脫除率升高，當(dāng)攪拌速度較快時(shí)，膽固醇脫除率隨時(shí)間延長(zhǎng)先增大后減小。這表明只有適中的攪拌速度和時(shí)間才能獲得較大的膽固醇脫除率，攪拌速度過(guò)高過(guò)低都不利于脫除膽固醇。同時(shí)需要指出的是X3X5的系數(shù)交互項(xiàng)是負(fù)值（-0.90），只考慮此交互效應(yīng)的話，負(fù)值表明隨響應(yīng)值Y1增加，攪拌速度X5和時(shí)間X3的編碼值需有不同的符號(hào)，即，一個(gè)必須大于零，另一個(gè)必須小于零［20］。即，當(dāng) Y1達(dá)到最佳值時(shí)，（X3，X5）＝（0.987，-0.639）。

圖1 單因子效應(yīng)圖

圖2 膽固醇脫除率響應(yīng)曲面圖

2.2 蛋黃油脂回收率（Y2）響應(yīng)面分析

2.2.1 建立回歸模型及顯著性檢驗(yàn)

對(duì)蛋黃油脂回收率（Y2）先建立一個(gè)二次回歸模型。由表4可知，二次回歸方程模型顯著（F2＝2.65，P＝0.008 3＜0.05），但是失擬檢驗(yàn)也顯著（F1＝8.43，P＝0.003 8＜0.05），說(shuō)明二次回歸模型雖然有意義但其在整個(gè)回歸空間內(nèi)的擬合度并不是很好，需要擬合更高次的回歸模型，即建立非標(biāo)準(zhǔn)模型。因每個(gè)因素都有5個(gè)水平，因此模型中可以包含四次項(xiàng)，選用逐步篩選法（αin＝αout＝0.10）對(duì)變量進(jìn)行篩選，通過(guò)計(jì)算機(jī)生成設(shè)計(jì)來(lái)找出一個(gè)更好的模型［19］。

表4 二次回歸方程顯著性檢驗(yàn)的方差分析

表5是新建的四次回歸模型的方差分析，可以看出對(duì)油脂回收率（Y2）建立的四次回歸模型明顯要優(yōu)于二次回歸模型［19］，有更大的 R2（0.973 9＞0.646 4），更小的變異系數(shù)（3.71% ＜10.48%）；且失擬檢驗(yàn)不顯著（F1＝0.72，P＝0.692 9），回歸模型極顯著（F2＝19.85，P＜0.000 1）。

表5 通過(guò)變量篩選的四次回歸模型、偏回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的方差分析

2.2.2 單因子及兩因子交互效應(yīng)分析

由表5可知，建立的蛋黃油脂回收率（Y2）四次回歸模型中 X1、X3、X4、X5、X1X2、X1X3、X1X4、X3X4、X3X5、X22、X52、X1X2X3、X1X2X4、X1X3X4、X1X3X5、X2X4X5、X12X4、X12X5、X1X22、X12X22是顯著項(xiàng)（P＜0.05）。各因子對(duì)蛋黃油脂回收率影響順序?yàn)椋簲嚢钑r(shí)間＞W(wǎng)∶O＞攪拌速度＞溫度＞β-CD∶O。相對(duì)于其他兩因子的交互效應(yīng)，W∶O與溫度、W∶O與β-CD∶O之間的交互效應(yīng)對(duì)蛋黃油脂回收率的影響更大。

從圖1b可知，W∶O（A）、溫度（D）、時(shí)間（C）在編碼區(qū)-1～+1內(nèi)增大時(shí)，蛋黃油脂回收率呈線性降低。β-CD∶O（B）在編碼區(qū)域內(nèi)，蛋黃油脂回收率隨編碼值增大先增加后下降。攪拌速度（E）的編碼值小于-0.862時(shí)，蛋黃油脂回收率隨編碼值增大而增加，隨后緩慢降低，當(dāng)編碼值大于0.00時(shí)，蛋黃油脂回收率迅速下降。

將其他因素固定在中心點(diǎn)時(shí)，得到另外兩因素對(duì)油脂回收率的響應(yīng)曲面圖（圖3a～圖3d）。較高的W∶O會(huì)降低油脂回收率（圖3a），因?yàn)檩^高的W∶O會(huì)降低蛋黃油黏度，在離心分離時(shí)有助于小顆粒的沉淀，因此回收率降低。

圖3 油脂回收率響應(yīng)曲面圖

2.3 優(yōu)化組合試驗(yàn)條件及驗(yàn)證試驗(yàn)分析

以膽固醇脫除率為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，當(dāng)（X1，X2，X3，X4，X5）＝（0.865，0.904，0.966，-0.962，-0.362），即實(shí)際值為：W∶O＝1.55，β-CD∶O＝0.295，時(shí)間24.83 min，溫度10.19℃，攪拌速度963.80 r／min時(shí)膽固醇脫除率理論值為73.30%。

以蛋黃油回收率為響應(yīng)值時(shí)，當(dāng)（X1，X2，X3，X4，X5）＝（-1.000，-0.058，-0.997，1.000，-0.750），即，在 W∶O＝0.80，β-CD∶O＝0.247，時(shí)間15.02 min，溫度20.00℃，攪拌速度924.99 r／min的條件下，蛋黃油回收率理論可達(dá)77.39%。

為了獲得滿意的綜合效果，使得膽固醇脫除率和蛋黃油脂回收率兩響應(yīng)值都達(dá)到最大，將二者作為共同考察指標(biāo)——渴求值（Desirability），通過(guò)渴求函數(shù)（Desirability Function）的響應(yīng)曲面圖、等高線圖優(yōu)化膽固醇脫除率和油脂回收率［5］，從而確定最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)曲面可以直接反映各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值影響的大小，由等高線圖可得到最佳條件下各試驗(yàn)因子的取值［21］。

將其他因子固定在最佳點(diǎn)處，W∶O和時(shí)間對(duì)渴求值的影響見(jiàn)圖4b，優(yōu)化的時(shí)間范圍為19～23 min，W∶O范圍為1.4～1.5。并且從圖4a可知在時(shí)間的所有水平內(nèi)，W∶O對(duì)渴求值的影響更大，W∶O超過(guò)1.45后渴求值降低。在低W∶O值時(shí)，時(shí)間變化對(duì)渴求值影響不大，W∶O值較高處，渴求值隨時(shí)間延長(zhǎng)先增大后減小。W∶O、β-CD∶O、攪拌溫度固定在最佳點(diǎn)時(shí)，渴求值的響應(yīng)曲面及等高線圖見(jiàn)圖5a～圖5b。在時(shí)間的所有水平上隨攪拌速度增大渴求值先增大后減小，優(yōu)化的攪拌速度范圍950～1 000 r／min。利用同樣的方法可以分析其他因子交互效應(yīng)對(duì)渴求值的影響。

渴求函數(shù)獲得最大渴求值時(shí)最佳工藝參數(shù)編碼值為（X1，X2，X3，X4，X5）＝（0.627，1.000，0.367，-1.000，-0.242），實(shí)際條件為 W∶O＝1.45，β-CD∶O＝0.30，時(shí)間21.83 min，溫度10℃，攪拌速度975.83 r／min。在此條件下，預(yù)測(cè)渴求值為0.752，膽固醇脫除率 Y1＝72.65%，蛋黃油回收率 Y2＝68.33%。

對(duì)優(yōu)化后最佳工藝條件A1（W∶O＝1.45，β-CD∶O＝0.30，時(shí)間21.83 min，溫度10℃，攪拌速度975.83 r／min）；膽固醇脫除率最高點(diǎn) A2（W∶O＝1.55，β-CD∶O＝0.295，時(shí)間24.83 min，溫度10.19℃，攪拌速度963.80 r／min）；蛋黃油回收率最高點(diǎn)A3（W∶O＝0.80，β-CD∶O＝0.247，時(shí)間 15.02 min，溫度20℃，攪拌速度924.99 r／min），3處不同的處理?xiàng)l件下的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。在優(yōu)化的最佳工藝條件下鴨蛋黃油脂膽固醇含量由51.47 mg／g降到15.33 mg／g，膽固醇脫除率達(dá)70.21%，蛋黃油回收率為68.7%，與理論預(yù)測(cè)值接近。驗(yàn)證了模型的可靠性，同時(shí)也說(shuō)明β-CD脫除蛋黃油脂膽固醇影響因素較多，工藝參數(shù)的變化會(huì)同時(shí)影響膽固醇脫除率和油脂回收率，2個(gè)指標(biāo)需合理權(quán)衡。

圖5 時(shí)間和攪拌速度的交互效應(yīng)影響渴求值的響應(yīng)曲面和等高線圖

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 結(jié)論

各因子對(duì)膽固醇脫除率的影響順序?yàn)椋簻囟龋睛?CD∶O＞時(shí)間＞攪拌速度＞W(wǎng)∶O；對(duì)蛋黃油脂回收率影響順序?yàn)椋簳r(shí)間＞W(wǎng)∶O＞攪拌速度＞溫度＞β-CD∶O。

通過(guò)對(duì)擬合的回歸方程中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次項(xiàng)溫度及W∶O與時(shí)間、時(shí)間與攪拌速度的交互效應(yīng)對(duì)蛋黃油脂膽固醇脫除率和油脂回收率都有顯著影響（P＜0.01）；W∶O與 β-CD∶O、W∶O與攪拌溫度、時(shí)間與攪拌溫度的交互效應(yīng)雖對(duì)膽固醇脫除率影響不顯著（P＞0.05），但對(duì)蛋黃油脂回收率有顯著影響（P＜0.01）。

利用渴求函數(shù)的響應(yīng)曲面圖、等高線圖優(yōu)化膽固醇脫除率和蛋黃油脂回收率，確定了最佳工藝條件：W∶O＝1.45（V／m），β-CD∶O＝0.30（m／m），時(shí)間21.83 min，溫度 10℃，攪拌速度 975.83 r／min。該條件下，預(yù)測(cè)渴求值為0.752，膽固醇脫除率理論達(dá)72.48%，蛋黃油脂回收率為68.05%；驗(yàn)證試驗(yàn)中鴨蛋黃油脂膽固醇含量由51.47 mg／g降到15.33 mg／g，膽固醇脫除率為 70.21%，油脂回收率為68.70%。

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