紫蘇分離蛋白及主要蛋白組分功能性質研究

姜文鑫 吳 丹 閔偉紅 譚雨青 劉惠麟 方 麗

（吉林農業大學食品科學與工程學院1，長春 130118）（小麥和玉米深加工國家工程實驗室2，長春 130118）

紫蘇（Perilla Prutescens Linn，Britton）為1年生唇形科植物［1］，在我國長白山地區較為豐富，是傳統的藥食兩用植物。近年來研究表明紫蘇具有多種生理功能［2-3］。如 Ha等［4］從紫蘇種子中分離和鑒定了具有抑制α-葡聚糖苷酶活力的5種酚類化合物。IharaM等［5］對比了紅花油和紫蘇籽油對小鼠血脂的影響，發現紫蘇籽油具有降血脂作用。Chang等［6］的研究證明了紫蘇油能夠降低小鼠血清中脂類和卵白蛋白IgG1含量，并且增加IgI的水平。Yang等［7］研究了紫蘇葉提取物對肝中毒的影響，發現紫蘇葉提取物具有保護肝臟的功能。以上研究主要集中在紫蘇葉提取物和紫蘇籽油的藥用價值方面，而對紫蘇蛋白的研究報道相對較少。

紫蘇籽含油量為30%～51%，被廣泛作為油料來源［8］，紫蘇粕是紫蘇籽脫脂后的工業副產品，在生產加工過程中一般作為動物飼料或直接拋棄，造成了資源浪費和環境污染。脫脂后的紫蘇粕蛋白質量分數可高達39%，而焙烤后的紫蘇籽蛋白功效比值、凈蛋白比值和真消化率分別為4.8%、79.8%、94.2%［9］，因此紫蘇籽蛋白是一種具有潛在開發價值的蛋白。本研究通過分離制備紫蘇分離蛋白、谷蛋白、球蛋白和清蛋白，并對比分析分離蛋白和3種主要蛋白組分的功能性質，為紫蘇蛋白的開發利用提供依據。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

脫脂紫蘇粕：敦化廣晟生物油脂有限公司。

5，5’ -二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）、考馬斯亮藍R-250、考馬斯亮藍G-250、β-巰基乙醇、過硫酸銨、丙烯酰胺、10%SDS、聚乙二醇、溴酚藍均購自Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FD-1B-50型冷凍干燥機：北京博醫康儀器有限公司；日立L-8900型氨基酸自動分析儀：日本日立公司；FE-20型實驗室pH計：瑞士梅特勒-托利多集團；UV-1700型分光光度計：日本島津；T-10均質機：德國IKA集團；SE-260型蛋白電泳儀：GE Healthcare Bio-Sciences AB；Z36HK高速冷凍離心機：德國HERMLE公司。

1.3 原料預處理與紫蘇分離蛋白的制備

脫脂紫蘇粕粉碎過40目篩，所得脫脂粉用乙醚溶劑在索式抽提裝置中抽提6 h，通風櫥內室溫晾干，脫脂粉裝入聚乙烯袋中，在-20℃儲存備用。

紫蘇分離蛋白通過堿溶酸沉法制備［10］。脫脂紫蘇粉與蒸餾水 1∶20（m／V）混合，2 mol／L NaOH調節pH至10.0，60℃水浴1 h，5 000 r／min離心10 min，取上清液，1 mol／L HCl調至等電點 pH 4.4，5 000 r／min離心 10 min，沉淀水洗 3次，用 1 mol／L NaOH調至pH 7.0，冷凍干燥，即得分離蛋白，過60目篩4℃儲存。

1.4 紫蘇蛋白質組分的分級提取

紫蘇分級蛋白按照Osborne法制備［11］：脫脂紫蘇粉與蒸餾水以1∶10混合，攪拌1 h，離心取上清液，重復提取3次，合并上清液去沉淀1，調節 pH 4.2，離心取沉淀調節至中性，裝入透析袋（分子質量8 000 ku）4℃透析3 d，聚乙二醇濃縮，冷凍干燥即得清蛋白；沉淀1用1 mol／L NaCl溶液1∶10提取，離心取上清液去沉淀2，重復提取3次，合并上清液，加入硫酸銨至50%飽和度，離心收集沉淀，處理過程同清蛋白；沉淀2用料液比1∶1070%乙醇提取3次，除去醇溶蛋白；沉淀繼續用1∶10 0.02 mol／L NaOH提取，處理過程同1.3部分中分離蛋白的提取工藝，得谷蛋白。

1.5 化學組成分析

根據 GB 5009.5—2010、GB 5009.3—2010、GB 5009.4—2010分別測定蛋白、水分和灰含量。

1.6 二硫鍵和巰基含量測定

總巰基（SHT）和暴露巰基（SH0）根據 Beveridge等［12］法進行測定，二硫鍵（SS）根據 Thannhauser等［13］方法進行測定。總巰基和暴露巰基含量按式（1）計算，二硫鍵含量按式（2）計算。

式中：A為412 nm處的吸光值；C為樣品濃度mg／mL；D為稀釋因子；73.53為 106／（1.36×104）；1.36×104是摩爾吸光系數，106由從 mol轉化為μmol／mL和從mg轉化為g換算得來。

1.7 氨基酸組成分析

蛋白樣品在含10 mmol／L苯酚和6 mol／L HCl的真空管中水解24 h。測定4種蛋白樣品的氨基酸組分，氨基酸含量結果表達為g／100 g蛋白。營養參數和氨基酸來源根據 FAO／WHO（2007）［14］。

1．8 SDS-PAGE

SDS-PAGE在不連續的緩沖系統中進行，電泳凝膠由12%的分離膠和5%的濃縮膠組成［15］。

1.9 總糖和還原糖的測定

總糖類物質根據Yem等［16］的方法對樣品進行預處理，還原糖采用3，5-二硝基水楊酸法測定［17］。

1.10 功能性質分析

1.10.1 蛋白溶解性

蛋白溶解性采用Aluko等［18］方法測定。上清液中蛋白含量通過考馬斯亮藍法測定［19］，總蛋白含量通過微量凱氏定氮法測定。蛋白溶解性為上清液蛋白和總蛋白質量分數的百分比，按照（3）計算。

1.10.2 起泡性和起泡穩定性

起泡性和起泡穩定性根據Tao等［20］的方法測定。按照式（4）計算。起泡穩定性表示為儲存30 min后的泡沫體積與之前的泡沫體積之比，按照式（5）計算。起泡性和起泡穩定性在pH 1～12范圍內測量。

式中：V1為攪打前溶液的體積；V2為攪打后的總體積；V3為攪打后30 min的體積。

1.10.3 乳化性和乳化穩定性

乳化性和乳化穩定性根據Chau等［21］方法測定。乳化性為乳化層體積占總體積的百分比，按照式（6）計算。樣品于80℃加熱30 min后，冷卻至室溫，4 000 r／min離心5 min，乳化穩定性為加熱后乳化層的高度占起初乳化層的高度的百分比，按照式（7）計算。

式中：H0為油水混合物起始高度；H1為乳化層高度；H2為30 min后乳化層高度。

1.10.4 持水和持油能力

持水和持油能力根據Tao等［20］的方法測定。按照式（8）計算每克樣品水或油的保持量。

式中：m0為離心管質量；m1為樣品質量；m2為持水／持油后的總質量。

1.11 統計分析

數據用Origin 7.5分析，所有試驗為3個平行。

2 結果與討論

2.1 紫蘇蛋白的主要組成

表1為PAP、PGP、PLP和PPI 4種蛋白樣品成分組成，蛋白質量分數分別為60.1%、82.9%、74.7%和86.1%。球蛋白的表面巰基和總巰基含量最高，分別為27.35μmol／g和36μmol／g大于其他蛋白，而谷蛋白的表面巰基和總巰基含量相對于其他3種蛋白最低，分別為 14.47μmol／g和 17.03μmol／g。表面巰基對蛋白溶解性呈正相關，這在溶解圖譜也有體現，球蛋白在pH 1～12范圍內的溶解性均高于谷蛋白。一般認為二硫鍵能夠穩定蛋白構象中的折疊結構減少構象的熵，因此能夠改善他們的熱力學穩定性［22］。二硫鍵的數量在谷蛋白中最高，由此可以推測谷蛋白的熱穩定性高于其他蛋白。

表1 紫蘇4種蛋白主要組成

2.2 氨基酸分析

表2為紫蘇分級蛋白和分離蛋白的氨基酸組成，由表2可知，紫蘇蛋白中氨基酸種類相對全面，含有人體所需的7種必須氨基酸：蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸，和1種半必需氨基酸酪氨酸。必需氨基酸含量高于FAO／WHO（2007）推薦成年人必須氨基酸每日攝取量，但低于推薦的兒童每日攝入量，因此可以滿足成年人對必需氨基酸的需求。在氨基酸或低聚肽的混合物中，支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的物質的量比稱為F值。高F制劑具有輔助治療或減輕肝性腦病能夠用于改善術后及臥床病人的蛋白營養狀況、抗疲勞等功效［23］。表2顯示的芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、脯氨酸）含量相對較少，這表明紫蘇蛋白是開發高F值制劑的潛在原料。

表2 紫蘇蛋白氨基酸組成／%

2.3 SDS-PAGE分析

圖1為SDS-PAGE圖譜，該圖譜顯示紫蘇各蛋白具有共同的亞基條帶，這與木通蛋白中報道的結果相類似［24］。PAP（1泳道）包含了3條濃度較大的條帶（10.5、20.1、27.8 ku）和2條較淺的條帶（40.6、42.3 ku）；PGP（2泳道）中主要包含分子質量為20.1、24.5、32.7和40.6 ku條帶；PLP（4泳道）亞基條帶分布與PGP基本相似，另外還包含2條與PPI（5泳道）相似的較淺條帶（36.7、37.5 ku）。PPI包含了PAP、PGP和 PLP顯示的所有亞基條帶（10.5、20.1、24.5、27.8、32.7、36.7、37.5和 40.6 ku），這表明分級提取的蛋白是分離蛋白某種程度的細化。其中10.5、20.1、32.7和40.6 ku的條帶濃度最大，為紫蘇蛋白主要的亞基組成。

圖1 紫蘇4種蛋白凝膠電泳圖

2.4 功能特性研究

2.4.1 蛋白溶解性

圖2顯示了pH 1～12范圍內紫蘇蛋白溶解性變化曲線，所有樣品的溶解曲線均呈現相似U型趨勢。PAP、PGP、PLP和PPI的溶解性在pH 1～4范圍內隨pH的增加溶解性逐漸減小，除PGP外均在pH 4.0時溶解性達到最小；PGP在pH 5.0時溶解性最小，這可能是因為組成蛋白分子的酸性亞基和堿性亞基的比例不同，導致了蛋白的等電點pH值也不相同，類似的現象出現在無患子蛋白［25］和非洲豆蛋白［26］的溶解性變化中。所有蛋白在pH大于等電點后溶解性逐漸增加，并在pH 12.0達到最大。隨著pH遠離等電點，蛋白分子延展程度增加，溶解性逐漸增大，然而在過酸或過堿的條件下，會引起蛋白結構的破壞，導致蛋白內部疏水基團暴露，使蛋白的溶解度下降，這可能是引起PLP在pH 1.0時溶解性下降的原因，相似的結果也在芝麻分離蛋白中觀察到［27］。相對于另外3種蛋白，PAP表現了最大的溶解性93.39%，這可能與PAP中含有一些糖類物質有關（表2中顯示PAP的糖類物質最高），糖類物質與蛋白結合會增大蛋白與水的結合能力。PGP、PLP、PPI的最大溶解性分別為88.35%、78.04%、85.19%。對比于其他蛋白，谷蛋白的溶解性相對較低，這一現象在也在木通種子谷蛋白中觀察到［24］。

圖2 pH對4種蛋白溶解性的影響

2.4.2 起泡性和起泡穩定性

圖3顯示了pH對4種蛋白起泡性和起泡穩定性的影響。PAP、PLP、PPI起泡性在pH 4.0時最低，分別為5.47%、4.05%、6.28%，與此同時PGP的起泡性在pH 5.0時達到最低為15.38%。PAP、PGP、PLP和PPI的起泡性最高值均在pH 12.0時被觀察到，分別為15.26%、47.19%、53.68%和35.19%。其中PAP的起泡性在pH 4.0時最低（5.47%），在pH 12.0時最高（15.26%），通常來說良好的溶解性是蛋白起泡性的先決條件，然而相對PAP較高溶解性，PAP起泡性較低并且受pH影響不明顯，這可能是因為PAP的平均疏水性較低，蛋白分子的柔性不適合在氣-液界面展開和重排，另外PAP中含有較高的糖類化合物，糖類的存在通常會抑制蛋白的起泡沫性，類似的現象也出現在蕓豆清蛋白中［28］。PGP在pH 1～3時顯示了與其他3種蛋白相反的變化，這可能是過酸環境破壞了球蛋白分子的部分結構，因而降低了蛋白的起泡能力，這與芝麻分離蛋白的報道相一致［27］。4種蛋白的溶解性與起泡性在pH 2～12的范圍內相關性非常明顯，這可能由于pH的上升或減少增加了蛋白分子在溶液中的柔性，使其更加容易擴散到空氣-水的界面上，因此提高了起泡性能力［29］。

圖3 pH對4種蛋白起泡性的影響

圖4顯示了紫蘇蛋白的起泡穩定性變化，PLP、PPI在pH 1～12范圍內起泡穩定性變化相類似，并在pH 10.0時穩定性達到最大分別為89.69%和86.53%，隨后逐漸下降，這可能是因為在過堿環境下，蛋白分子結構遭到破壞對氣-液界面造成不穩定影響，同樣現象也被報道在銀杏的清蛋白、球蛋白和分離蛋白起泡穩定性變化中［24］。PGP在pH 5～10范圍內與PLP、PPI的變化趨勢基本一致，并在pH 10.0時穩定性達到最大93.62%，隨后迅速降低。值的注意的是PAP的穩定性曲線有2個波峰，1個波峰在pH 10.0，另1個在pH 4.0，在堿性范圍內，起泡穩定性的變化趨勢類似于另外3種蛋白，而在pH 4.0時（即等電點附近），起泡穩定達到最高達72.2%，這是由于在等電點時蛋白分子間的排斥力很小，有利于蛋白分子相互作用，形成黏稠的吸附膜穩定較好［24］，而另外3種蛋白在遠離等電點時氣泡穩定性增加，可能是因為隨著蛋白濃度的增加，蛋白質分子在空氣-水界面間的相互作用增強，提高了氣泡穩定性［28］。

圖4 pH對4種蛋白起泡穩定性的影響

2.4.3 乳化性及乳化穩定性

圖5顯示了4種蛋白乳化性與pH值的變化關系。其中PLP和PPI在pH 4.0時的乳化能力最低，分別為1.72%和24.22%；PAP和PGP的乳化性在pH 5.0時達到最低，分別為37.21%和31.91%。不同的蛋白達到最大乳化值的pH各不相同，其中PAP在pH 8.0時達到最高為41.39%。PAP的乳化性隨pH變化不明顯，這是因為當pH值遠離等電點時，影響了氨基酸側鏈的解離，產生了有利于乳濁液中穩定的靜電斥力，避免了液滴的凝集，提高蛋白對水的結合能力，使乳化性增加［30］。當pH大于9.0時蛋白的部分發生了變性，使乳化能力減弱，類似結果也出現在銀杏蛋白中［20］，相同的解釋也適用于另外3種蛋白。對于PAP乳化能力高于其他3種蛋白可能是PAP分子上高度親水區和高度疏水區域是隔開的，所以乳化性相對較好，乳濁液的油滴直徑更小［31］。PLP在pH 3～6范圍內乳化性較低，這與谷蛋白的溶解性是密切相關的，結合PAP和PGP的溶解性變化趨勢可以得出一個結論，良好的溶解性是乳化性的先決條件，但乳化性與溶解性并不成正相關關系，這一結論與Mcwatters等［32］的研究報道相一致。

圖5 pH對4種蛋白乳化性的影響

圖6 pH對4種蛋白乳化穩定性的影響

由圖6可以看出，乳化穩定性依pH的變化趨勢與乳化性依pH的變化趨勢相類似，這表明乳化性越高乳化穩定性越好。相類似的結論在之前的蕓豆研究中也被報道［33］。PAP在pH 1.0時乳化穩定性最高為93.64%，這可能是因為PAP分子較小所以形成的乳化油滴直徑更小，乳化微粒間庫倫排斥力較大，因此乳化性相對較好。PPI的乳化穩定性最高值在pH 12.0時被觀察到為92.76%。與此同時各蛋白的乳化穩定性最低值均在等電點處。

2.4.4 持水和持油性

蛋白持水性是指蛋白將水截留在組織中的能力，持水性對食品的嫩度、多汁性、柔軟性具有重要的實際意義。從圖7中可以看出，相比于其他3種蛋白，PAP的持水性最好為 3.81 mL／g；PGP、PLP、PPI的持水性分別為 1.77、3.05、2.96 mL／g。PAP的持水性高于PGP，類似的結果也體現在菜豆清蛋白和球蛋白的持水性對比中［33］。紫蘇分離蛋白的持水性高于豇豆分離蛋白2.2 mL／g［34］和芝麻分離蛋白的2.1 mL／g［32］。早期的報道表明持水性在 1.49～4.72 mL／g范圍內的蛋白適用于黏性食品［34］，因此紫蘇蛋白可以滿足在食品高持水構造方面的應用，具有開發潛質。

圖7 PAP、PGP、PLP和 PPI的持水性

圖8 PAP、PGP、PLP和 PPI的持油性

持油能力對乳化能力有直接影響，是非常具有實際價值的特性，例如在蛋黃醬制作中。由圖8可知，PAP持油性最高為3.93 mL／g，這可能是因為相比于其他蛋白，具有更加開放的分子結構，PGP持油性為 2.58 mL／g，高于紅小豆球蛋白 1.4 mL／g［29］和菜豆球蛋白1.87 mL／g［33］。PLP的持油能力為 3.59 mL／g，PPI的持油能力是3.36 mL／g，2種蛋白持油性均高于豇豆分離蛋白的1.10 mL／g［34］和蠶豆分離蛋白的 2.31 mL／g［35］。對比于其他植物蛋白，紫蘇蛋白尤其清蛋白部分，持水性、持油性普遍高于其他植物蛋白，因此在食品加工體系添加用于改善食品的品質具有良好的前景，例如在炸面包圈、香腸、冰淇淋等食品的工過程中。

3 結論

本試驗對比研究了Osborne法提取的清蛋白、球蛋白、谷蛋白與紫蘇分離蛋白的功能性質，結果表明紫蘇蛋白的功能性受pH因素影響較大。PAP的溶解性、持水性、持油性、乳化性較好；PGP的氨基酸組成較為合理，巰基含量相對較高，起泡穩定性最好；PLP的起泡性和乳化穩定表現最好，二硫鍵含量較高，PPI中包含了另3種蛋白的所有條帶，并且所有性質均處在分級蛋白的范圍之間，因此實際應用中可以根據不同性質的需要選擇相應的蛋白。相對于其他植物蛋白，紫蘇蛋白具有相對全面和較好的物理和化學性質，具備食品應用的開發潛質。

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