人脂聯素基因重組腺病毒對內皮細胞MCP－1和ICAM－1表達的影響

王桂杰，冷吉燕，盧新衛，張 婧，葛媛媛

（吉林大學第一醫院 干部病房，吉林 長春130021）

脂聯素（adiponectin，ADPN）是脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白質，具有改善胰島素抵抗、抗炎、抗動脈粥樣硬化、降血糖、保護血管內皮等作用［1］，生理濃度范圍內的脂聯素通過抑制NF－κB信號傳導通路能夠劑量依賴性地抑制腫瘤壞死因子（TNF－α）誘導的血管內皮細胞黏附分子的表達。本研究通過將人脂聯素基因重組腺病毒感染人臍靜脈內皮細胞（human umbilical veins endothelial cells，HUVECs），研究其對人臍靜脈內皮細胞分泌單核細胞超化因子1（MCP－1）和細胞間粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM－1）和mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：DMEM高糖培養基和胎牛血清（美國GIBCO公司）；人脂聯素ELISA檢測試劑盒（美國RD公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）和臺盼藍（德國Sigma）；人脂聯素基因重組腺病毒（Ad－apM1）和報告基因LacZ重組腺病毒（Ad－LacZ）由本課題組構建和制備。

細胞：低代數的HEK293細胞株（中國科學院上海細胞生物學研究所）；新生兒無菌臍帶采集自吉林大學第一醫院婦產科。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒的制備、擴增、純化和滴度測定 從人脂肪組織克隆人脂聯素基因apM1，利用基因重組方法將其構建到腺病毒粘粒載體pAxCAwt，應用COS/TPC方法，將左向轉錄的重組腺病毒粘粒載體pAxCAwt1apM1、pAx－CAwt1LacZ（對照腺病毒）分別與 Ad5DNA－TPC共轉染HEK293細胞，經同源重組產生重組腺病毒。在HEK293細胞中大量擴增病毒，病毒上清經氯化銫密度梯度離心純化后保存于－80℃備用。用50% 組織培養感染劑量法（TCID50）測定病毒滴度。

1.2.2 人臍靜脈內皮細胞的體外培養 參照 Nachman等［2］方法，在無菌條件下取健康新生兒臍帶25－30cm，灌入0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃ 消化10min。離心收集內皮細胞，用完全M199［含20%胎牛血清、內皮生長因子（endothelial cell growth factor，ECGF）20mg/L、青霉素1×105U/L和鏈霉素100mg/L］接種細胞于T25細胞培養瓶中，置37℃，5%CO2培養箱中培養。當細胞融合成單層時，以0.02%乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）消化傳代，實驗用第1－3代。

1.2.3 實驗分組 將細胞隨機分為4組：對照組、TNF－α刺激組（以20μg/L TNF－α刺激）、空載體轉染組（先以20μg/L的TNF－α刺激，然后用半自動光學檢查儀（manual optical Znspector，MOI）為50的 Ad－LacZ轉染 HUVECs）和脂聯素轉染組（先以20μg/L的TNF－α刺激，然后用 MOI為50的脂聯素重組腺病毒轉染HUVECs）。各組細胞培養24、48、72h后分別取上清備用。

1.2.4 HUVECs中脂聯素蛋白水平的檢測：按照人脂聯素的ELISA試劑盒說明書測定標準品及各孔細胞培養上清液中脂聯素蛋白含量。450nm可見光比色的吸光值（A）對標準品中脂聯素蛋白含量繪制標準曲線，將細胞上清液中測得的吸光值在標準曲線上確定其中脂聯素蛋白含量。

1.2.5 HUVECs中 MCP－1和ICAM－1蛋白水平的檢測：采用雙抗體夾心ABC－ELISA方法進行檢測。將分組處理后的細胞分別取細胞上清液100μl，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，最后于酶標儀490nm處讀數，并將數值按照標準曲線轉換成相應濃度值。

1.2.6 MCP－1和ICAM－1mRNA 表達的檢測：轉染 HUVEC后7d收集細胞。按照說明書，采用T rizol法提取總RNA，并測定其濃度及純度。取2μgRNA進行逆轉錄，合成cDNA。以此為模板用ICAM－1、MCP－l引物經PCR方法進行 擴 增。ICAM－1 正 義 鏈 5’－CACAGGTGGTGCTTCTGAAC－3’，反義鏈5’－C 代 CTGAGCCTTCTGTAACTTG－3’。MCP－1 正 義 鏈 5’－GGTGTCCCAAAGAAGCTGTAG－3’，反義鏈5’－TC代 TGTCATACTGGTCACTTC－3’。內參CAPDH 正義鏈 5’－AAGAACAGGCTCTTAGCA－3’，反 義鏈5’－CCAGTAGACTCCACGACAT－3’。ICAM－1 的 擴 增條件：95℃5min，94℃1min，57℃1min，72℃2min，共35個循環，最后72℃延伸10min，終產物為496bp。MCP－l的引物擴增條件：95℃5min，94℃1min，52℃30s，72℃1min，共30個循環，最后72℃延伸10min，終產物為283bP。應用凝膠成像分析系統分析圖像，結果用目的片段/GApDH片段的條帶吸光度（A）比值表示。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多樣本間均數的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組腺病毒的擴增、純化和滴度測定 Ad－apM1和Ad－LacZ在HEK293細胞中獲得了大量擴增，經氯化銫密度梯度離心純化后，TC ID50測定病毒滴度為2×1011PFU/ml。

2.2 原代及傳代HUVECs的鑒定 原代培養時，細胞接種后4h開始貼壁生長，貼壁細胞呈扁平多角形或梭形，邊界清楚，胞質豐富，細胞核為圓形或橢圓形，核內染色質稀疏空亮，核仁1或2個；細胞為單層，互不重疊，細胞間相互連接呈鋪路石狀鑲嵌排列。傳代細胞中可見多個雙核及核分裂細胞，有時可見多核及巨細胞。

2.3 重組腺病毒對內皮細胞的感染率 MOI為50時，HUVEC的感染效率約90%。

2.4 人脂聯素基因重組腺病毒蛋白的表達 用MOI為50的人脂聯素基因重組腺病毒感染 HUVECs24、48、72h后，取上清檢測脂聯素濃度分別為（123±14）ng/ml、（161±15）ng/ml、（150±10）ng/ml。TNF－α刺激組、空載體轉染組和對照組24、48、72h均未檢測到脂聯素蛋白。

2.5 各組HUVECs MCP－1和ICAM－1蛋白及 mRNA的表達 TNF－α刺激組和空載體轉染組MCP－1和ICAM－1的蛋白及mRNA表達水平明顯高于對照組（P＜0.01）；與TNF－α刺激組和空載體轉染組相比，脂聯素轉染組HUVECs MCP－1、ICAM－1蛋白及 mRNA的表達明顯降低（P＜0.01）。（表1、2）

表1 各組HUVECsICAM－l和MCP－l蛋白表達（±s）

表1 各組HUVECsICAM－l和MCP－l蛋白表達（±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.01；b與TNF－α刺激組比較，P＜0.01；c與空載體轉染組比較，P＜0.01。

組別 MCP－1（ng/L） ICAM－1（ng/L）265.8±46.84 406.36±98.34 TNF－α刺激組 1653.6±66.45a 2104.57±78.55a空載體轉染組 1633.5±71.14a 2136.43±89.36a脂聯素轉染組 458.4±54.37bc 475.76±69.31對照組bc

表2 各組 HUVECsMCP－l和ICAM－lmRNA表達（相對A，±s）

表2 各組 HUVECsMCP－l和ICAM－lmRNA表達（相對A，±s）

注：a與空白對照組比較，P＜0.01；b與 TNF－α刺激組比較，P＜0.01；c與空載體轉染組比較，P ＜0.01。

0.452±0.035 0.258±0.023 TNF－α刺激組 1.232±0.064a 0.602±0.058a空載體轉染組 1.245±0.057a 0.613±0.043a脂聯素轉染組 0.453±0.055bc 0.291±0.024 MCP－1mRNA ICAM－1mRNA對照組組別bc

3 討論

脂肪組織除了具有儲存能量的功能外，還具有活躍的內分泌功能［3］，其合成和分泌的多種具有血管活性的激素和細胞因子，統稱為脂肪因子。目前已知脂肪組織分泌的脂肪因子有瘦素（leplin）、TNF－α、纖溶酶原激活物抑制劑（plasminogen activator inhibi－tor，PAI）、抵 抗 素 （resistin）、白 介 素－6（IL－6）、脂聯素，其中，脂聯素是脂肪細胞分泌的一種較為特異的蛋白質，具有胰島素樣血管活性，其抗動脈粥樣硬化及抗炎作用而備受關注［4］。脂聯素與TNF－α在高級結構上具有高度的相似性，均通過三聚化球狀結構域與受體結合。研究顯示，脂聯素的許多抗炎作用是通過抑制TNF－α介導實現的［5］。人體內血漿脂聯素濃度為5－30mg/L，在血漿中主要以全長脂聯素和球形脂聯素兩種形式起作用，后者生理作用更為重要。脂聯素涉及脂質代謝紊亂、血管內皮細胞損傷、巨噬細胞及T細胞浸潤、平滑肌細胞增生、血小板黏附等多種病理生理過程，在內皮細胞炎癥反應和動脈粥樣硬化發生發展過程中發揮著重要作用。

ICAM－1是介導細胞與細胞、細胞與基質之間相互作用的糖蛋白，在動脈粥樣硬化等病理過程中起著重要作用。MCP－1對單核或巨噬細胞有趨化和激活作用，可誘導其產生白介素－6，促進黏附分子表達。人們認為內皮細胞、白細胞和血小板之間以及與血管內皮基質間相互黏附、相互作用而導致炎癥反應，從而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展［6］。當細胞活化時，ICAM－1的表達量迅速上升［7］，可使內皮細胞易于“捕獲”中性粒細胞，并促進其遷入動脈壁，促進斑塊內炎癥反應。高水平MCP－1可以吸引單核細胞黏附并浸潤動脈壁，這一過程促使粥樣斑塊更進一步形成。ICAM－1可介導白細胞與內皮細胞的滾動和穩定黏附，并繼而在MCP－1等炎性因子的協助下穿越血管表層［8］，介導單核細胞和T細胞的滾動和黏附，啟動局部的炎癥反應。

本研究首先觀察了TNF－α在體外對臍靜脈內皮細胞的刺激作用，結果顯示，血管內皮細胞經TNF－α刺激后，MCP－1、ICAM－1的蛋白和mRNA表達增加，說明TNF－α對血管內皮具有損傷作用。通過腺病毒載體將脂聯素基因導入HUVECs，發現重組脂聯素能夠抑制TNF－α引起的 MCP－1、ICAM－1蛋白和mRNA的表達的增高，提示脂聯素通過抑制MCP－1、ICAM－1表達，而具有重要的抗炎、抗動脈粥樣硬化和心血管保護作用。正如發現TNF－α在炎癥中的重要作用而出現的以TNF－α為靶標的生物制劑，深入研究重組脂聯素在動脈粥樣硬化發病過程中的作用，可能為動脈粥樣硬化的治療提供新的靶標和方向。

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