三孢布拉氏霉中β-胡蘿卜素的提取研究

余茜煒，向夢雄，左 樂，蔡 俊，王常高

(湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，湖北武漢 430068)

β-胡蘿卜素是聯合國糧農組織和世界衛生組織一致認定的A類營養色素，不僅是人體內維生素A的重要來源，且具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、增強免疫等功能，在醫藥、食品著色及營養強化、日用化妝品及飼料添加劑等領域具有廣闊的應用前景[1]。目前，市場上的β-胡蘿卜素產品主要有化學合成品和天然產品2種類型。天然β-胡蘿卜素因其功能性強、安全性好及生物利用度高等優點而日益受到人們的青睞[2]。發酵法是目前生產天然β-胡蘿卜素的主要途徑，在可合成β-胡蘿卜素的微生物中，三孢布拉氏霉無論是生物量(可達50 g干菌體/L)，還是菌體細胞中β-胡蘿卜素含量(可達菌體干重的1%～5%)都是最理想的，已成為目前國內外研究和生產天然β-胡蘿卜素的主要菌種[3]。

湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室近年來一直致力于β-胡蘿卜素的發酵生產研究，前期已完成發酵條件優化等方面的研究[4]。由于β-胡蘿卜素是一種脂溶性很強的胞內產物，因此如何將β-胡蘿卜素從三孢布拉氏霉菌絲體中提取出來并進行不同程度的分離純化也是發酵法生產天然β-胡蘿卜素的關鍵技術問題。筆者主要對三孢布拉氏霉菌絲體中β-胡蘿卜素提取的溶劑種類及條件進行了初步的摸索研究，以期為今后的工業化大規模生產提供一定的依據和參考。

1 材料與方法

1.1材料供試菌絲體是湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室采用100 L發酵罐利用三孢布拉氏霉正、負菌株結合發酵培養所得。新鮮菌絲洗凈后在50 ℃下真空干燥24 h得干菌絲體。干菌絲體采用氣流式超微粉碎機粉碎得干菌粉。該試驗研究均為同一罐發酵所得菌絲體。

試驗所用的無水酒精、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、正己烷和石油醚(60～90 ℃沸程)均為分析純。

1.2β-胡蘿卜素的提取及提取率計算精確稱取0.1 g的干菌粉，加入一定體積的各種不同溶劑，在不同的溫度和時間下進行浸提，然后離心(8 000 r/min，5 min)，取上清液用浸提時所用的相應溶劑進行適當稀釋，測定其在波長450 nm下的吸光度，根據標準曲線算出浸提稀釋液中β-胡蘿卜素的濃度，再根據稀釋倍率，浸提時所用溶劑的體積及干菌粉的質量計算出β-胡蘿卜素的提取得率。

提取得率=nCV/m(mgβ-胡蘿卜素/g干菌體)

式中，n為浸提液的稀釋倍率；C為浸提稀釋液中β-胡蘿卜素的濃度；V為浸提時所用溶劑的體積；m為干菌粉的質量。

2 結果與分析

2.1β-胡蘿卜素標準曲線精確稱取β-胡蘿卜素標準品(Sigma公司)，用60～90 ℃沸程的石油醚溶解并稀釋成一系列不同濃度，分別測定其在波長450 nm下的吸光度。以β-胡蘿卜素的濃度為橫坐標，以各自的吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結果見圖1。

圖1 β-胡蘿卜素標準曲線

2.2溶劑種類對β-胡蘿卜素提取得率的影響精確稱取干菌粉0.1 g，加入1.5 ml的不同溶劑，在40 ℃下浸提2 h，分別測定不同溶劑對β-胡蘿卜素的提取得率，結果見圖2。

圖2 溶劑種類對β-胡蘿卜素提取得率的影響

從圖2可以看出，乙醇的提取得率較低，這可能與乙醇的極性較大而β-胡蘿卜素極性較弱有關。但石油醚、丙酮、正己烷和乙酸乙酯4種溶劑對β-胡蘿卜素的提取得率相差不大，沒有明顯的差異。因此，理論上這4種溶劑均可用于三孢布拉氏霉干菌體中β-胡蘿卜素的提取。但實際生產中，除考慮提取得率之外，還要考慮溶劑的成本和安全性及溶劑的回收利用等因素。因此，后面的提取條件研究中，選擇了價格相對便宜的石油醚作為提取溶劑。

2.3料液比對β-胡蘿卜素提取得率的影響精確稱取干菌粉0.1 g，分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25 g/ml的料液比加入石油醚，在40 ℃下浸提2 h，分別測定在不同料液比下β-胡蘿卜素的提取得率，結果見圖3。

圖3 料液比對β-胡蘿卜素提取得率的影響

從圖3可以看出，隨著料液比的減小，β-胡蘿卜素提取得率逐漸增加。當料液比達到1∶15 g/ml時，提取得率達到最大值。料液比進一步減小，提取得率沒有明顯的增加，反而會使溶劑的用量增加，提取液濃度下降，增加溶劑回收的工作量和成本。因此，提取料液比達到1∶15 g/ml即可。

2.4提取時間對β-胡蘿卜素提取得率的影響精確稱取干菌粉0.1 g，按1∶15 g/ml的料液比加入石油醚，在40 ℃下浸提不同時間，分別測定在不同浸提時間下β-胡蘿卜素的提取得率，結果見圖4。

圖4 提取時間對β-胡蘿卜素提取得率的影響

從圖4可以看出，隨著浸提時間的延長，β-胡蘿卜素的提取得率逐漸增加。當浸提時間達到2 h時，提取得率達到最大值。浸提時間進一步延長，提取得率不再增加，反而有所下降，這可能是β-胡蘿卜素在光照下不穩定分解所致。因此，提取時間2 h即可。

2.5提取溫度對β-胡蘿卜素提取得率的影響精確稱取干菌粉0.1 g，按1∶15 g/ml的料液比加入石油醚，在不同的水浴溫度下浸提2 h，分別測定在不同浸提溫度下β-胡蘿卜素的提取得率，結果見圖5。

圖5 提取溫度對β-胡蘿卜素提取得率的影響

從圖5可以看出，當溫度較低時，隨著溫度的提高，β-胡蘿卜素的提取得率逐漸增加。這可能是因為溫度升高，分子擴散運動加快，有利于色素分子向溶劑中的溶解。但當溫度超過40 ℃時，提取得率不再增加，反而有一個明顯的下降，這可能是溫度過高，加上光照的作用，加速了β-胡蘿卜素的氧化分解。因此，提取溫度達到40 ℃即可，不宜過高。

3 討論

目前，有大量文獻報道了從各種不同的天然植物原料中提取類胡蘿卜素的研究，所得出的最佳溶劑種類不盡相同，有丙酮、乙酸乙酯、石油醚或它們的混合溶劑[5-7]，但該試驗研究結果卻表明，丙酮、乙酸乙酯、石油醚和正己烷4種溶劑對三孢布拉氏霉干菌體中β-胡蘿卜素的提取得率相差不大，沒有明顯的差異，這可能與不同的原料中胡蘿卜素的分布及結合狀態不同有關。陳鵬等報道了利用超聲法從三孢布拉氏霉中提取β-胡蘿卜素的研究，所得出的最佳溶劑是乙酸乙酯[8]，這可能與菌株來源不同及發酵條件不同等有關。

6號溶劑油(又稱6號輕汽油)是目前國內浸出法生產植物色拉油的主要溶劑，其使用技術的可靠性和安全性已得到廣泛的認可。6號溶劑油的主要成分是正己烷和環己烷的混合物，其對三孢布拉氏霉干菌體中β-胡蘿卜素的提取得率應與前面4種溶劑相差無幾。由于該溶劑使用量大，供應充足，價格也相應便宜，因此在今后的大規模發酵生產中，利用6號溶劑油從三孢布拉氏霉干菌體中提取β-胡蘿卜素也應是一個很好的選擇。

該試驗研究從三孢布拉氏霉干菌體中提取β-胡蘿卜素，其提取得率比從其他天然動植物原料中的提取得率普遍要高出很多，盡管所使用的菌種還只是從中國典型培養物保藏中心購買的原始出發菌株。這也充分說明，微生物發酵法依然是生產天然β-胡蘿卜素的理想方法，相比天然原料提取法而言，具有產量高、不受環境因素影響、安全及成本低等優勢。湖北工業大學發酵工程教育部重點實驗室今后將對發酵菌株進行多輪誘變選育，以進一步提高發酵產量，降低成本，從而為今后的工業化大規模生產奠定基礎。

[1] 王雪.β-胡蘿卜素的研究進展[J].中國化工貿易，2013(5)：193.

[2] 13種食品著色劑國家標準初稿完成[J].中國釀造，2010(11)：159.

[3] 張婷婷，葛佳，牛天貴，等.三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素發酵條件的研究[J].食品科技，2009，11(34)：2-7.

[4] 顏作文，王常高，蔡俊.三孢布拉氏霉菌產β-胡蘿卜素發酵條件的優化[J].食品與發酵科技，2013，49(2)：25-29.

[5] 甄天元，幕鴻雁.橙皮中類胡蘿卜素的提取工藝研究[J].安徽農業科學，2012，40(29)：14493-14495.

[6] 趙永彬，尹明安.不同溶劑對胡蘿卜中類胡蘿卜素提取的影響[J].安徽農業科學，2005，33(4)：671，673.

[7] 王敏，祝淵靜，趙國良，等.天然胡蘿卜素的提取及分離[J].重慶理工大學學報：自然科學版，2010，24(3)：28-32.

[8] 陳鵬，王婧，陳聰，等.超聲法提取三孢布拉氏霉中的β-胡蘿卜素[J].大連工業大學學報，2009，28(6)：418-420.