野生貴州地寶蘭無菌播種及根狀莖繁育技術研究

藍玉甜，韋新蓮，黃 嵐，羅玉婷，辛榮仕，張自斌

(廣西雅長蘭科植物國家級自然保護區管理局，廣西樂業 533209)

貴州地寶蘭[Geodorumdensiflorum(Lam.)Schltr]是廣西樂業縣雅長蘭科國家級自然保護區的特有種植物，是一種很有開發價值的野生蘭，具有觀賞、藥用等多種用途，于2004年貴州寶蘭在廣西雅長蘭科保護區被發現，轟動了植物學界，因為這一物種在人們的視野中已經“消失”了80多年[1]。

貴州地寶蘭首次被發現并命名是在1921年被德國植物分類學家Schletchter根據在貴州羅甸采集地唯一的一份標本命名及描述后，人們就沒有在野外發現過該種，以至于我國分類學家在編寫中國植物志時，只能參考德國植物分類學家的描述來記載[2]。貴州地寶蘭在廣西出現，無疑具有重要的科研價值，貴州地寶蘭花大且花瓣呈玫瑰紅色，《中國植物志》(2006年版)記載：“這在國產種類中是獨一無二的”。因此，貴州地寶蘭在花卉園藝產業中價值不可估量。該物種現在存數有限，瀕臨滅絕，是極度瀕危物種。筆者主要研究貴州地寶蘭人工繁育方法，旨在為貴州地寶蘭的以后的人工大量繁育及野外種群恢復提供可靠的繁育技術和種苗。

1 材料與方法

1.1材料利用廣西雅長蘭科自然保護區野外貴州地寶蘭(圖1)種群在花期進行人工授粉，從授粉之日起4～5個月后，蒴果成熟，取下蒴果作為外植體進行無菌播種培養。

圖1 貴州地寶蘭野外生長情況

1.2方法

1.2.1材料表面消毒。取近成熟但未開裂的蒴果，先用自來水沖洗果表面3～5 min；然后用濃度75%的酒精棉球擦拭蒴果表面；接著用濃度0.1 mol/L的KOH溶液浸泡，不斷搖蕩，15～20 min后，再用無菌水沖洗5次，每次3～5 min，最后用無菌濾紙吸干蒴果表面水分，放置備用[3]。

1.2.2無菌播種及培養條件。蒴果消毒好之后，在超凈工作臺沿果中縫線縱向切開，利用無菌鑷子夾起蒴果均勻的將種子撒播到每瓶培養基表面上，培養條件為前15 d弱光培養，后期光照強度在1 500～2 000 lx，每天光照10～12 h，培養溫度為(25±2)℃。

1.2.3種子無菌萌發培養基的制備。1.0 g/L Hyponex1和1.0 g/L Hyponex2+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L ZT +100.0 mg/L CM+20 g/L蔗糖+1.0 g/L AC+5.5 g/L瓊脂，pH 5.4，種子萌發率可達80%。

1.2.4原球莖增殖培養基的制備。采用MS、1/2MS、N6和B5為基本培養基，分2組添加不同激素，第1組附加0.5 mg/L NAA；第2組添加0.5 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA；將大小一致、重量相等的根狀莖，分別轉接到處理編號分別為(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)和(8)培養基中(表1)，研究不同培養基成分和不同激素對貴州地寶蘭原球莖增殖的影響，每個培養瓶接種20顆原球莖，重復10次，培養條件為光照(2 000～2 500)lx，光照12 h，培養溫度(25±2)℃[4-5]。

表1 原球莖增殖培養基組成

注：1/2MS主要是大量元素減半，其他不變，所用到的香蕉汁都采用熟香蕉搗碎后所得汁液。馬鈴薯采用水煮后所過濾得的汁液。

1.2.5根狀莖誘導芽分化培養。采用MS、1/2MS、N6和B5為基本培養基，分2組添加不同激素，第1組附加2 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA激素；第2組添加0.5 mg/L NAA和1.0 mg/L 6-BA激素，將大小一致的根狀莖，分別轉接到處理編號為(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)和(16)培養基中(表2)，研究不同培養基成分對貴州地寶蘭根狀莖誘導芽分化的影響，每個培養瓶接種10個根狀莖，重復10次，培養條件為光照(2 000～2 500)lx，光照12 h，培養溫度(25±2)℃[6]。

表2 根狀莖誘導芽分化培養基組成

1.2.6生根壯苗培養基的制備。原球莖分化成苗后，分別轉到以B5為基本培養基，添加IAA不同激素濃度，主要是研究不同濃度IAA對苗生根壯苗的影響。所以選取狀態一致的小苗接種到處理編號為(17)、(18)、(19)和(20)4種生根培養基中(表3)，每個培養瓶接15株小苗，重復10次，培養60 d后統計生根率及生長結果，培養條件為光照3 000 lx，光照12 h，培養溫度(27±2)℃。

2 結果與分析

2.1種子無菌播種快繁種子無菌播種后，先進行30 d弱光培養，待種子萌發成白色原球莖后，采用1 500～2 000 lx的光照強度再培養40 d，發現原球莖變綠，生長健壯，這時要及時轉接到增殖培養基，因在舊的培養基中培養時間過長，培養基酸化，養分減少，對后期的苗增殖、分化、生長都有一定的影響，所以要及時轉接才能獲得健壯的小苗。

表3 生根壯苗培養基組成

2.2不同培養基對原球苗增殖效果為尋找最適合貴州地寶蘭原球莖增殖培養基，利用種子在播種培養基上培養70 d后的原球莖轉入增殖培養基中，將這些原球莖轉到不同成分的培養基上，附加相同濃度的0.5 mg/L NAA或0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA的激素，轉接15 d左右，原球莖表面不同程度的出現細小的白色絨毛，原球莖都有不同程度的膨大，增殖過程中有的原球莖成團狀，有的成根狀莖，轉入增殖培養基培養50 d后，觀察統計8組培養基對原球莖增殖發育情況。

由表4可知，在試驗的8種培養基中，原球莖都有不同程度的增殖。原球狀莖的增殖倍數進行統計分析結果表明，培養50 d后，在8組培養基上的增殖倍數都有差異，但1號與5號培養基的差異顯著(P<0.05)，且原球莖的增殖情況有很大的差別，這與生長調節劑和添加附加物的種類有關，培養基只加0.5 mg/L NAA和加馬玲薯100.0 g/L后，增殖倍數達0.150；當培養基里多添加激素0.5 mg/L BA，附加物改為香蕉100.0 g/L后，原球莖增殖倍數反而有所下降，6、7和8號培養基的結果與其相同。因此，確定最利于貴州地寶蘭原球狀莖增殖培養基為：B5+0.5 mg/L NAA +100.0 g/L馬鈴薯+30.0 g/L蔗糖+5.8 g/L瓊脂，pH 5.4(圖2)。

表4 不同培養基對原球莖增殖試驗結果

圖2 貴州地寶蘭根狀莖

2.3根狀莖分化成芽試驗結果將在光照條件下培養60 d生長健壯的根狀莖轉入分化培養基進行培養，60 d后統計其分化芽數，觀察不同培養基及不同激素對根狀莖分化出芽率，篩選出最適合貴州地寶蘭根狀莖分化芽的培養基(圖3)。由表5可知，MS、1/2MS、B5和N6的培養基都能誘導根狀莖成芽，但添加不同激素后，成芽率各有不同。統計分析結果表明，培養60 d的根狀莖在9到12號培養基中芽的誘導率差不多，在13～15號培養中也相差不大，但15號培養基中芽的誘導率最高且苗粗壯，即B5為基本培養基，添加0.5 mg/L NAA+1.0 g/L 6-BA時芽的誘導率可達(100%)，且芽長得粗壯。當NAA濃度升高而6-BA降低時，芽的長勢卻越來越差。根狀莖在4種基本培養基中分化芽都是差不多的，但添加激素濃度不同，芽的長勢也有所差異。因此，確定最適合根狀莖分化成芽的培養基為：B5+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+100.0 g/L香蕉汁+25.0 g/L蔗糖+1.0 g/L AC，pH 5.4～5.5。

表5 根狀莖分化成芽試驗結果

圖3 貴州地寶蘭的增殖苗

2.4生根壯苗結果當芽長到6～7 cm時，從芽的根部切割轉入以B5為基本培養基的生根壯苗培養基中，60 d后統計生根數據。由表6可知，17號培養基的生根率最高，苗也長得最高。當添加1.0 mg/L NAA時，生根率可達93.3%，而且苗高粗壯，根系發達(圖4)。而20號培養基生根率最低，當添加4.0 mg/L NAA時，根少，較細小，生根率低。結果表明，隨著添加NAA的濃度逐漸升高，生根率反而降低。因此，最適合無菌苗生根培養基的配方是：B5+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+100.0 g/L香蕉汁+25.0 g/L蔗糖+1.5 g/L AC，pH 5.3～5.5。

表6 生根壯苗試驗結果

圖4 貴州地寶蘭生根苗

3 結論與討論

(1)貴州地寶蘭種子在野外比較難獲得，在大自然中自然授粉比較困難，大部分都是要經過人工授粉才能獲得種子，所以取材料時要選好時間，在果莢近成熟時要及時采收和播種，不要等全成熟后才釆收，播種時果莢容易開裂，而且播種時要撒播均勻，這樣生長出的原球莖才比較均勻、健壯。

(2)貴州地寶蘭小苗在培養基上生長時，出現褐化比較嚴重，特別培養超過70 d后，培養基褐變特別多，而且小苗的葉尖變黃。在試驗播種階段，播種后先采用暗光培養15 d后才轉入有光培養，而且原球莖增殖到一定程度時，要及時的將原球莖轉接到新的培養基上，這樣可以控制和減少褐變出現；而且，試驗中添加吸附劑活性碳。不管是播種還是增殖、分化、生根等，培養基里都使用活性碳，活性碳對防止褐變有明顯的效果，活性碳能夠吸附各階段苗生長過程中釋放出的醌類物的傷害。

(3)生長調節劑和附加物的使用：生長調節劑使用及濃度控制起著十分關鍵的作用，能決定種子是否萌發，原球莖增殖、分化成芽，生根等。一般都采用生長素NAA、細胞分裂素6-BA、ZT，但各階段不用，添加的濃度也要有所差異，在播種階段，采用1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L ZT，在原球莖增殖階段采用0.5 mg/L NAA，分化階段采用0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，生根階段1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA。附加

物是一些天然提取物，包括有香蕉、土豆、椰汁等，所含的成分不同，但主要有效成分為氨基酸、植物激素等，對培養物器官組織或細胞有一定的促進生長作用。試驗在原球莖增殖中作了2組試驗，1組加香蕉，1組加土豆，添加土豆的增殖率比較好，香蕉就比較差，但在生根階段又采用了香蕉提取物，根系發達，苗粗壯；說明香蕉提取物對貴州地寶蘭在增殖有抑制作用，但對生根壯苗確非常有利。

[1] 馮昌林，蔡樹威，鄧振海.雅長林區貴州地寶蘭的瀕危原因及保護對策[J].廣西林業，2012(9)：43-44.

[2] 陳心啟，吉占和，朗楷永.中國植物志[M]．北京：科學出版社，1976：190.

[3] 胡琦敏，王任翔，黃云峰.地寶蘭的離體快速繁殖[J].植物生理學通訊，2007，43(2)：309-310.

[4] 胡琦敏.地寶蘭無菌播種快繁技術及原球莖的形態研究[D].桂林：廣西師范大學，2007.

[5] 程麥風.大花惠蘭的組織培養和快速繁殖技術研究[J].農業科技通訊，2004(3)：24-25.

[6] 馬杰，何蔚紅，崔波.蝴蝶蘭原球莖的誘導增殖[J].河南科學，2005，23(1)：51-53.