響應(yīng)面法優(yōu)化白扁豆多糖的提取條件

于 鑫， 徐 敏

(1.惠州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣東惠州 516003；2.惠州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣東惠州 516003)

中藥材白扁豆來源于豆科(Leguminosae)植物扁豆(DolichoslablabL.)的干燥成熟種子[1]，為藥食兼優(yōu)之物，營養(yǎng)豐富，含有脂肪油、蛋白質(zhì)、尼克酸、氨基酸、維生素及糖類等成分，還含有微量元素及鈣、磷、鐵等，另含有磷脂類成分[2]。其以種子、種皮(扁豆衣)、花(扁豆花)供藥用或食用。基于白扁豆的醫(yī)藥價(jià)值，現(xiàn)代人對(duì)白扁豆的研究越來越重視。近些年來，有關(guān)白扁豆的藥材鑒別、化學(xué)成分、藥理作用、產(chǎn)品開發(fā)研究的報(bào)道較多，但關(guān)于其多糖類成分提取工藝方面的研究鮮有報(bào)道。

生物總多糖類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。此外，多糖化合物還廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜和植物、微生物的細(xì)胞壁中，是由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物，也是構(gòu)成生命的4大基本物質(zhì)之一。總多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及抗癌、降血糖、治療肝腎疾病及消炎鎮(zhèn)痛、美容和乳化等作用[3]。筆者采用響應(yīng)面分析法對(duì)白扁豆中的總多糖提取工藝進(jìn)行探討，優(yōu)選白扁豆總多糖的最佳提取工藝，以期為更好地利用白扁豆奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。白扁豆，產(chǎn)地為安徽亳州，打成粉末備用。

1.1.2主要儀器。AUY-120萬分之一電子天平，購自日本島津公司；UV1102紫外分光光度計(jì)，購自上海山美公司；TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)，購自北京時(shí)代北利離心機(jī)廠；ZF-90型暗箱式紫外投射儀，購自鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，蘇州江東精密儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海百典儀器設(shè)備有限公司。

1.1.3主要試劑。所用試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2方法

1.2.1白扁豆多糖的提取。準(zhǔn)確稱取足夠量白扁豆藥材粉末，加入8倍量濃度95%乙醇，回流脫脂2次，每次2～3 h。將乙醇提取后的藥渣揮干至無醇味；每次取白扁豆適量，加適量的水提取；抽濾，濾液冷卻后濃縮至50～100 ml。向濃縮后的濾液加入適量的乙醇，使乙醇的最終濃度為80%，室溫靜置24 h；離心機(jī)離心10 min(4 000 r/min)，將沉淀用適量的水溶解，定容于容量瓶，得到一定濃度的白扁豆粗多糖溶液。

1.2.2含量測(cè)定。采用苯酚-硫酸法測(cè)定白扁豆多糖含量[3-4]

1.2.3多糖提取的單因素試驗(yàn)。精確稱取預(yù)處理過的白扁豆若干份，每份3.000 g，置于三角瓶中，放置在超聲提取儀中提取，白扁豆多糖提取試驗(yàn)優(yōu)化條件主要包括提取時(shí)間(20、40、60、80和100 min)、料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70，W/V，g/ml，下同)、溫度(40、50、60和70 ℃)，針對(duì)這幾個(gè)提取條件分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察其對(duì)提取率的影響，選擇最佳提取條件。

1.2.4BoxBehnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的提取條件范圍，采用Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以水提時(shí)間、水提溫度、料液比這3個(gè)對(duì)多糖得率影響明顯的工藝參數(shù)作為自變量，以粗多糖得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法對(duì)白扁豆多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化(表1)。

表1 BoxBehnken的中心組合因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果圖1(A)表明，隨溫度的增加，粗多糖提取率呈升高趨勢(shì)。在溫度70 ℃時(shí)粗多糖提取得率最大，多糖往往與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，溫度過高，會(huì)影響多糖的提取率。因此，選擇70 ℃為最佳提取溫度。圖1(B)表明，隨著提取時(shí)間的延長，多糖得率有升高趨勢(shì)，并且從20～80 min升高趨勢(shì)較快，從80～100 min則較為緩慢，因此選擇80 min為最佳提取時(shí)間。圖1(C)表明，料液比為1∶60時(shí)提取率達(dá)到最大值，考慮到節(jié)約成本和后續(xù)濃縮步驟，提取溶劑用量不宜太大，故料液比以1∶60較適宜。

圖1 提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)對(duì)白扁豆粗多糖提取率的影響

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化白扁豆多糖的提取條件采用Box-Behnken程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，各因素經(jīng)回歸擬合后，由Box-Behnken程序計(jì)算得到回歸方程為：

Y=0.75+0.11A+0.048B+0.068C-0.040AB+0.050AC+0.045BC-0.046A2+0.034B2-0.061C2

式中：Y為多糖得率；A為提取溫度：B為提取時(shí)間：C為料液比。當(dāng)“Prob>F”值小于0.05即表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著(P<0.05)。分析結(jié)果表明，整體模型的“Prob>F”小于0.01，表明該2次方程模型高度顯著。回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果表明，方程的1次項(xiàng)、2次項(xiàng)的影響都是顯著的(P<0.05)，并且交互項(xiàng)CB、AC、與AB項(xiàng)也顯著(P<0.05)。因此，各試驗(yàn)因子對(duì)相應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。該模型的R2=0.984 2，RadjR2=0.963 8，說明該模型擬合效果較好，可以用于白扁豆多糖最佳提取工藝的理論預(yù)測(cè)。

2.3響應(yīng)面及等高線根據(jù)擬合函數(shù)，固定一個(gè)因素“0”為水平處理，分析另外2個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響，作出響應(yīng)面和等高線圖。圖2～4直觀的給出了各個(gè)因子交互作用響應(yīng)面的3D和等值線圖。比較3組圖可知，溫度對(duì)多糖得率的影響最為顯著(P<0.05)，表現(xiàn)為曲面較陡；而料液比與時(shí)間次之，相應(yīng)表現(xiàn)為曲面較為平滑，這與回歸分析的結(jié)果相吻合。通過軟件Design-Expert 6.0求得最佳的提取方案為：A=1；B=1；C=1，即水提溫度為70 ℃，水提時(shí)間為100 min，料液比為1∶70；在此條件下，白扁豆多糖的得率最高，可到達(dá)0.96%。

表2 BoxBehnken的中心組合設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

圖2 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)白扁豆粗多糖提取率影響的響應(yīng)面與等高線

圖3 料液比和提取溫度對(duì)白扁豆粗多糖提取率影響的響應(yīng)面與等高線

圖4 料液比和提取時(shí)間對(duì)白扁豆粗多糖提取率影響的響應(yīng)面與等高線

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)為了驗(yàn)證模型的實(shí)用性和準(zhǔn)確性，以水提溫度為70 ℃，水提時(shí)間為100 min，料液比為1∶70的條件進(jìn)行多糖提取。3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際多糖得率為0.94%，與理論值相差0.02。因此，響應(yīng)面法對(duì)白扁豆多糖提取條件的優(yōu)化時(shí)可行性的，得到的提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過響應(yīng)面方法得出3個(gè)因素對(duì)白扁豆中多糖得率的影響從大到小依次是:溫度>料液比>時(shí)間。根據(jù)分析，確定白扁豆中總多糖的最佳提取工藝條件為:提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間100 min，料液比為 1∶70；按此條件提取出的白扁豆多糖得率比其他組和條件得到的白扁豆多糖得率要高，3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際多糖得率為0.94%，與根據(jù)方程推算最高得率相差0.02，可見此條件為白扁豆中多糖的提取的最優(yōu)條件。

[1] 中華人民共和國藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[2] 李仕海，劉訓(xùn)紅.白扁豆及其變種的理化鑒別[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2001,12(6)：508.

[3] LI X M,LI X L,ZHOU A G.Evaluation of Antioxidant Activity of the Polysaccharides Extracted from Lycium barbarum fruits in vitro[J].European Polymer Journal,2007,43(2):488-497.

[4] LUO Q,CAI Y Z,YAN J,et al.Hypoglycemic and Hypolipidemic Effects and Antioxidant Activity of Fruit Extracts from Lycium barbarum[J].Life Sci,2004,76:137-149.