響應面法優化玉米芯中低聚木糖的酶法提取工藝

姚 笛 葉曼曼 李 琳 樊 蕾 孟 超 楊 健

（黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319）

（浙江諾倍威生物技術有限公司2，杭州 310035）

低聚木糖系由2～7個木糖分子以α-1，4糖苷鍵結合而成［1］，具有很強的增殖腸道益生菌［2］、改善腸道微生態環境等功能［3-4］，它的甜度比蔗糖和葡萄糖均低，具有抗齲齒作用［5］。低聚木糖作為一種非消化性糖，理化性質穩定，耐酸、耐熱，是一種功能性食品配料［6-7］，被認為是目前最有前途、國內外研究最為廣泛的功能性低聚糖之一。

低聚木糖的生產主要是以富含木聚糖的植物（如玉米芯、棉籽殼、麩皮等）為原料，通過木聚糖水解酶酶解而得的一種低聚糖［8-9］，制備低聚木糖的原料多為木聚糖提取率較高的木質纖維素，玉米芯中含有大約35%的半纖維素、35%的纖維素和15%的木質素，其中半纖維素的主要組成為木聚糖，它通過降解可生產低聚木糖［10-11］。目前，我國對玉米芯的利用相對來說還很少，除少量進行初加工外，絕大部分作為農家燃料被燒掉，既浪費了資源又污染環境，我國對低聚木糖的研究起步較晚，與一些發達國家相比，在技術和工藝上都有一定程度的差距。近年來，由于低聚木糖市場需求的持續增長，對其生產工藝的技術要求也不斷提高。因此，以價廉易得的玉米芯為原料，研究開發低聚木糖產品具有極大的競爭力和市場開發前景［12-14］。本研究旨在開發高附加值的低聚木糖，以玉米芯為原料，通過響應面法對酶法提取低聚木糖的工藝進行優化，為玉米芯資源的有效利用提供了基礎數據，具有重要的生態效益和經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米芯：大慶市郊區；木聚糖酶：本實驗室利用球毛殼霉發酵后分離純化獲得；木聚糖：sigma公司；D-木糖、3，5-二硝基水楊酸、乙醇等為國產分析純。

1.2 玉米芯木聚糖粗品的制備

采用堿法提取木聚糖粗品，具體流程為：干燥的玉米芯粉→堿法浸提→上清液→過濾→粗提液→中和→沉淀→離心→水解→醇沉→離心→烘干沉淀→得木聚糖粗品。

1.3 酶解木聚糖制備低聚木糖

取木聚糖粗品，用蒸餾水浸泡12 h制成木聚糖濃縮液，調pH為5.7，添加木聚糖酶，搖床水浴振蕩酶解，過濾，重復3次，取其上清液進行還原糖含量的測定。

1.4 單因素試驗

以木聚糖底物濃度、木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時間4個影響玉米芯中低聚木糖含量的因素做單因素試驗，確定各因素適宜的范圍。

1.5 響應面分析法試驗設計

響應面分析法試驗設計在單因素試驗基礎上，確定中心組合試驗設計的自變量及其水平。根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以還原糖含量為指標，選取木聚糖底物濃度、木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解時間4個因素，設計四因素三水平響應面分析試驗，用響應面分析（Response surface analysis，RSA）方法對數據進行回歸分析及顯著性檢驗，以確定酶處理的最優工藝條件。每個試驗點重復3次，取試驗結果的平均值。其中各自變量的因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表

1.6 還原糖含量測定

還原糖含量采用 DNS法測定（以木糖計，g／L）［15］。

1.7 酶解液組分分析

采用高效液相色譜法分析最優條件下玉米芯酶解液中低聚木糖的主要成分［16］，色譜條件：色譜柱為Suga KS-802柱；檢測器為515示差折光檢測器；流動相為超純水；流速0.8 mL／min；進樣量5μL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 底物濃度對還原糖含量的影響

由圖1可知，隨著木聚糖底物濃度的增加，酶解液中還原糖含量逐漸增加，酶解后酶解液中還原糖含量在木聚糖底物濃度為1%～5%時逐漸增加，而在3%～5%時還原糖含量增加不明顯。因此，為節省原材料，宜選用木聚糖底物濃度3%。

圖1 底物濃度對還原糖含量的影響

2.1.2 木聚糖酶添加量對還原糖含量的影響

由圖2可知，隨著木聚糖酶添加量的增大，酶解液還原糖含量逐漸增加，加酶量為40 mL／g時還原糖含量最高，所加酶量以40 mL／g較好。

圖2 加酶量對還原糖含量的影響

2.1.3 酶解溫度對還原糖含量的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，酶解液的還原糖含量先逐漸增加后有所降低，溫度過高對木聚糖酶活力有一定的影響，因此，酶解溫度為60℃時還原糖含量最高。

圖3 酶解溫度對還原糖含量的影響

2.1.4 酶解時間對酶解液還原糖含量的影響

由圖4可知，隨著酶解時間延長，酶解液的還原糖含量先增加后減少，3～5 h增加明顯，5～7 h有所降低，處理5 h時酶解液的還原糖含量最高，所以酶解時間以5 h較好。

圖4 酶解時間對還原糖含量的影響

2.2 響應面法優化低聚木糖提取工藝參數分析

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

響應面法優化低聚木糖提取工藝試驗結果如表2，通過Design Expert數據分析軟件進行回歸分析，得到的方差分析結果如表3所示。由表3可知，底物濃度的一次項達到極顯著水平（P＜0.01），加酶量的一次項達到顯著水平（P＜0.05），表明這2個因素對還原糖含量的線性效應顯著，所有二次項對還原糖含量的曲面效應極顯著，交互項AB、AD交互效應顯著（P＜0.05），表明各影響因素對還原糖含量的影響不是簡單的線性關系。表3分析結果可見，整體模型的P值小于0.000 1，該二次方程模型達到極顯著水平，并且失擬項不顯著（P＞0.05），說明該回歸方程對數據進行了較好擬合，二次回歸方程為：R＝3．82＋0．17A＋0．12B＋0．08C-0．07D-0．18AB＋0．02AC-0．26AD-0．06BC-0．04BD-（5．00E＋003）CD-0．95A2-0．43B2-0．25C2-0．41D2

表2 響應面分析方案及試驗結果

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 響應面以及等高線分析結果

響應面圖是響應值在各試驗因子交互作用下得到的結果構成的一個三維空間曲面。根據回歸方程繪制響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀。圖5、圖6是對響應值還原糖含量影響較大的兩因素交互作用的響應面，其他因素交互作用不顯著。

圖5 底物濃度和加酶量對還原糖含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

由圖5可知，底物濃度在（3%～4%）范圍內，木聚糖酶添加量在（40～50 mL／g）范圍內時，兩者存在著顯著的增效作用，還原糖含量隨著底物濃度和木聚糖酶添加量的增加而增加；而當底物濃度量在（2%～3%）范圍內，木聚糖酶添加量在（30～40 h）范圍內時，還原糖含量隨著兩個因素的增加而減少。由圖6可知，底物濃度在（3%～4%）范圍內，酶解時間在（5～6 h）范圍內時，兩者存在著顯著的增效作用，還原糖含量隨著底物濃度和酶解時間的增加而升高；而當底物濃度在（2%～3%）區間，酶解時間在（4～5 h）還原糖含量隨著兩個因素的增加開始降低。

圖6 底物濃度和酶解時間對還原糖含量交互影響的三維曲面圖和等高線圖

為了確定最佳點的值，對試驗模型進行分析，以得到高還原糖低聚木糖的最佳制備工藝條件，經分析得出最佳制備條件為：底物濃度為3%，加酶量為41 mL／g（底物），51℃時酶解4.88 h所得的低聚木糖含量最高，3.88 mg／mL。為檢驗試驗的可靠性，采用上述最優提取條件進行玉米芯中低聚木糖的提取，同時考慮到實際操作的便利，最佳條件修正底物濃度為3%，加酶量為40 mL／g（底物），50℃時酶解5 h所得的低聚木糖含量為3.86 mg／mL。與預測值比較可知，本試驗優化得到的最佳條件參數準確可靠，具有實用價值。

2.3 優化條件下酶解液的組分分析

采用HPLC對玉米芯酶解液中低聚木糖組分進行分析，低聚木糖標準品的HPLC圖譜如圖7所示，從圖7可以看出，1號峰為木糖，出峰時間11.426 min，2號為木二糖（10.324 min），3號為木三糖（9.875 min），4號為木四糖（9.216 min），5號為木五糖（8.571 min）。酶解液中低聚木糖組分的HPLC圖譜如圖8，由積分面積可知低聚木糖（木二～木五）的相對含量達68.1%，說明此水解條件能夠較好的制備低聚木糖。

圖7 低聚木糖標準品HPLC圖譜

圖8 酶解液中低聚木糖組分的HPLC圖譜

3 結論

采用Box-Behnken中心組合試驗設計，經響應面分析結合實際值確定玉米芯酶法制備低聚木糖的最佳工藝條件為底物濃度3%，加酶量為40 mL／g（底物），50℃時酶解5 h所得的酶解液中還原糖含量為3.86 mg／mL。能夠使玉米芯中的木聚糖充分水解得到低聚木糖，并通過HPLC進行水解產物的分析，證明水解產物中含有較高的木二糖、木三糖、木四糖及木五糖等低聚木糖組分，低聚木糖（木二～木五）的相對含量達68.1%，因此說明優化的水解條件能夠較好的制備低聚木糖。

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