酶免疫測定法檢測糞便孕酮進行母豬早期妊娠診斷的研究

馮建剛，魏全偉，李 巖，石放雄

（南京農業大學動物科技學院，南京 210095）

養豬業是我國畜牧業中的支柱產業，在生豬養殖業中，繁殖效率是決定母豬養殖經濟效益的關鍵因素之一。母豬繁殖率的高低取決于發情鑒定、配種授精、妊娠檢查及接產等多種技術。

母豬的早期妊娠診斷是提高母豬繁殖效率和畜牧業生產效益的重要技術措施，尤其是配種后20d前后的早期妊娠診斷是母豬繁殖技術中十分重要的內容。對母豬而言，每耽誤5.5個發情周期就少產1窩。因此，母豬配種后20d前后的早期妊娠診斷尤為重要。

動物體液中孕激素的含量變化主要是由于卵巢黃體發育和退化的結果，發情期孕酮水平最低，黃體期孕酮水平較高，妊娠期孕酮水平則一直維持在較高水平[1-2]。類固醇激素可在動物血液中迅速被結合，通過不同的途徑分泌到尿液和經膽汁排到腸道中，通過與葡萄糖醛酸或硫酸鹽結合，形成水溶性的無活性的葡萄糖苷酸或硫酸鹽而被排泄到糞便和尿液中[3]。因此，測定糞便等樣品中孕酮含量能進行卵巢機能監控。目前用于監測孕酮含量的方法主要有以下幾種：放射免疫測定法，使用放射性物質標記，具有很高的檢測靈敏度及穩定性，但儀器設備昂貴，且有放射性污染；酶免疫測定法，使用酶標記，靈敏度僅次于放射免疫測定法，儀器設備相對便宜；乳膠凝集試驗測定法，用了特化的乳膠珠，靈敏度和重復性均不如前兩種方法。目前雖有使用獸用B型超聲波診斷的，一般也需在輸精后35d以上才能進行。

在國內母豬養殖中，監測糞樣孕酮含量以提高母豬繁殖效率的技術，還未能在基層養殖場及養殖農戶推廣應用。本文建立了簡便實用的母豬糞樣孕酮含量的酶免疫測定法，并用于母豬早期妊娠診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品及試劑

孕酮多克隆抗體、酶標抗原與ELISA試劑盒均由南京農業大學動物繁殖研究室自行制備[4]，常規試劑均為分析純購于國藥集團。

1.2 試驗儀器

酶標儀為美國Bio-TEK產品、型號為ELX800；振蕩器、精密電子天平、加樣器、烘箱、96孔酶標板（購于Geriner公司），WED-2000AV型獸用掌上B型超聲診斷儀等常規儀器。

1.3 糞樣采集及測定

1.3.1 糞樣采集

母豬來源于灌云縣畜旺生豬養殖場,所有母豬均在相同條件下進行飼養管理，采集配種后21～25d母豬（共164頭）的糞便作為檢測對象。

1.3.2 糞樣處理

收集母豬糞便并稱0.5g溶于20mL蒸餾水中，離心（3000r/min，10min），取上清液，置于4℃冰箱待測。

1.3.3 樣品測定

包括如下8項程序：

①包被抗體:用包被緩沖稀釋液將孕酮抗血清稀釋成包被工作液，在已編號的載體板各孔內(第12列E、F、G、H排的4孔除外)加抗血清稀釋液200μL加蓋4℃冰箱中靜置24～48h；

②封閉：舍去內容物，封閉液封閉包被孔，每孔280μL，37℃放置2h；

③洗滌：取出反應板甩掉封閉液，用洗滌液洗滌3次，吸水紙吸干；

④加樣：在包被板A排第1～12列和F排第1～11列各孔內依次加稀釋后的待測樣本100μL，B和C排重復A排加樣,G和H排重復F排加樣，D和E排按照濃度低至高的順序依次加標準抗原，每個梯度重復3次；

⑤加酶標物：加樣后將板置于4℃冰箱中，配制酶標物，取出載體板，在各孔內加酶標物100μL,置37℃培養箱中反應2h；

⑥洗滌：取出反應板，甩掉反應液，用洗滌液洗滌3次，吸水紙吸干；

⑦加底物液：配制底物液，在各孔內加底物液200μL，室溫避光反應0.5h，此時反應液呈橙黃色；

⑧加終止液：各孔加終止液50μL，此時反應液呈棕黃色；讀取OD492nm值，將OD492nm值換算為孕酮濃度。

1.3.4 母豬早期妊娠診斷

配種后母豬糞樣中孕酮的含量超過150ng/g時，就可確認其妊娠；小于150ng/g時，可初步確認其空懷。

1.4 標準曲線的制作[4]

選擇合適的抗體濃度包被、合適的酶標抗原工作濃度，制作標準曲線。標準曲線以系列稀釋濃度的孕酮標準液建立測定梯度,并以各濃度(包括0ng/ mL)的OD492nm值轉換成E/E0值，其中無孕酮標準時的OD492nm值為E0，各相應濃度的孕酮標準時的OD492nm值為E，E/E0×100%=Alnx+B(x為樣本中孕酮濃度)。因為E/E0值與lnx成線性回歸關系,從而可以計算回歸曲線的方程和相關系數。

1.5 獸用B超診斷母豬早期妊娠

1.5.1 操作方法

在限飼欄內，母豬側臥、趴臥或站立姿勢均可以操作，不需保定。用濕毛巾擦凈腹部污物。母豬側臥與趴臥時在探查部位涂布耦合劑，而站立時則在探頭上涂布耦合劑。將探頭與體軸平行，靠近股內側或倒數第2～3對乳頭，查到膀胱后，向膀胱上部或側面掃查。妊娠早期，探頭朝向恥骨前緣，骨盆腔入口方向，或以45°角斜向對側上方，探頭緊貼皮膚一點，進行前后和上下的定點扇形掃查。隨妊娠日齡的增加，探查部位逐漸前移，最后可達肋骨后端。

1.5.2 結果判定

如顯示孕囊或胚胎的斷層像診斷為懷孕；顯示兩側未孕子宮的斷層像為空懷。

1.6 數據處理

數據采用Execl軟件和x2檢驗進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 測定糞樣P4酶免法的建立

將定量的P4標準進行梯度稀釋,建立的典型標準曲線如圖1。

在一般操作情況下,結合率(E/ E0)與孕酮濃度的自然對數lnx之間的典型直線回歸方程式為:E/E0=-10.7 1lnx+62.751(r=-0.9947)。

2.2 方法學鑒定[4]

對建立的方法進行方法學鑒定，結果如下：靈敏度8ng/g,回收率為95.78%；重復性，重復測定高、中、低水平樣本中的孕酮含量,板內和板間變異系數分別為6.8%(n=9)和11.23%(n=8)，穩定性好；特異性，用50%置換法測得孕酮抗體與雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反應率均小于0.01%，與睪酮交叉反應率為0.35%。

2.3 獸用B超診斷母豬早期妊娠

2.3.1 空懷的聲像圖特征

空懷母豬膀胱前方的子宮區域顯示回聲均勻的子宮角影像，對超聲的反射弱，呈各種不規則的圓形弱反射區，子宮內檢測不到孕囊或孕體，如圖2所示。

2.3.2 妊娠的聲像圖特征

在配種35d后，妊娠母豬子宮內能非常清楚地看到孕囊，大小隨著妊娠期的延長而增大，甚至能發現胎體，直徑6～10cm。胎兒骨骼反射增強，出現一閃一閃的胎動，增強的骨骼出現聲影，如圖3所示。

圖1 孕酮標準曲線

圖2 空懷母豬B超聲像圖

圖3 35 d妊娠診斷的聲像圖

2.4 母豬早期妊娠診斷的結果

對灌云縣畜旺豬場的164頭初產母豬進行了糞便孕酮含量的測定，用母豬糞便孕酮酶免疫法測定配種后21～25d母豬糞樣中孕酮濃度，測定結果分布如圖2所示。配種后母豬糞樣中孕酮的含量超過150ng/g時，確認其妊娠；小于150ng/g時，確認其空懷。由所測結果得知，除了配種后21、24d時各檢測出1頭，25d時檢測出4頭為空懷（合計6頭）外，其他的均為妊娠，與后來的診斷結果完全一致。

通過母豬糞便孕酮酶免疫法檢測配種后21～25d糞樣孕酮濃度進行早期妊娠診斷和獸用B超對配種35d后妊娠診斷的準確率如表1所示，基于糞樣孕酮水平的妊娠診斷標準，配種后21d的準確率為96.1%，22d的為100%，23d的為100%，24d的為96.3%，25d的為84%，妊娠診斷準確率95.9%(140/142)；空懷診斷的準確率為72%(13/18)；獸用B超對配種35d后母豬妊娠診斷的準確率為97.3%。如果連續2d進行妊娠診斷，其診斷準確率有顯著的提高。

圖4 配種后21～25 d母豬糞樣孕酮濃度（實心黑點為妊娠，空心點為空懷）

3 討論與結論

已有很多文獻報道通過檢測血液中的孕酮并根據孕酮水平變化信息來進行母豬的發情鑒定、妊娠鑒別及卵巢疾病診斷，但采集血液會對動物產生一定的應激并且煩瑣[6]。本文用母豬糞便孕酮酶免疫法以糞樣為檢測樣品，對母豬做早期的妊娠診斷。研究結果表明，母豬糞樣孕酮酶免疫法是一種實用、安全可靠和高效的早期妊娠診斷方法。

Hultén等人監測了在同一個發情周期中母豬糞便和血液中孕酮濃度的變化，結果表明，除了糞樣中孕酮的變化比血液中約推遲了2d外，糞便中孕酮濃度的變化與血液孕酮濃度的變化趨勢基本相似。有報道在同一個發情周期中糞樣雌激素的變化也比血液中的變化推遲2d左右[7]。進一步說明血液中的類固醇激素經由肝臟代謝，以葡萄糖苷酸或硫酸鹽通過消化道最終糞便的方式排出體外，此過程約需要2d的時間。在臨床應用中，測量糞便中類固醇激素濃度時必須考慮這一點。配種后血液中孕酮濃度約19～23d達到很高水平，因此，本實驗通過糞樣孕酮酶免疫法進行早期妊娠診斷，需要檢測配種后第21～25天的糞樣孕酮濃度。以糞樣中孕激素濃度150ng/g為妊娠診斷的臨界點，是根據母豬妊娠或空懷測定糞樣孕激素濃度的平均數加減2個標準差為基準而確定的，該結果與Masaharu等(2010)的研究結果基本相似。通過母豬糞便孕酮酶免疫法對母豬進行的早孕診斷的準確率為95.9%；空懷診斷的準確率為72%；如果連續2d進行診斷，其診斷準確率有顯著的提高。獸用B超對配種35d后母豬妊娠診斷的準確率為97.3%。雖然獸用B超妊娠診斷的準確率較糞便孕酮酶免疫法高，但一般也需在輸精后35d以上才能進行，而使用酶免疫激素測定技術就可在輸精后1個情期（21～25d）進行準確的妊娠診斷。因此，應用此方法能盡早作出妊娠診斷，這對于保胎，減少空懷，縮短產仔間隔，提高繁殖率和經濟效益具有重要意義。

表1 配種后21～25d母豬早期妊娠診斷的準確率

總之，用母豬糞便孕酮酶免疫法進行早期妊娠診斷，快速，準確，收集樣本方便，此外，并不需要任何特殊的設備或技術。因此，母豬糞便孕酮酶免疫法進行早期妊娠診斷有較高的臨床適用性，更有利于在養豬場（戶）中推廣和應用。

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[4]馮建剛，李巖，龔新明,等.母豬糞便孕酮酶免疫測定法的建立及其初步應用[J].畜牧與獸醫，2013，45(9):37-39.

[5]HulténF.ZhangBR,ForsbergM,eta1.App lyingaprogesteroneassaytofeca lsam p lesco llectedfromsow sduringtheoestrouscycle[J].Rep rod. Dom.Anim，1995，30:101-105.

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