煙蚜繭蜂毒蛋白對寄主生長發育的影響

李艷紅

(吉林農業工程職業技術學院，吉林 四平 136001)

煙蚜繭蜂(Aphidius gifuensis)是寄生蔬菜、果樹、棉花和大田作物上蚜蟲的一種寄生蜂。作為一種害蟲生物防治的重要因子，在溫室以及大田中，煙蚜繭蜂都起到了很重要的作用[1]。有關內寄生蜂對鱗翅目寄主的作用國內外有大量報道，但在半翅目蚜蟲上還很少，主要表現在寄主的免疫抑制與發育受阻上[2]，如寄主降低生長速度、延遲發育[3]，減少脫皮素的產量[4]，減少血淋巴細胞數目、轉化及改變行為[5]。寄生蜂產生的毒蛋白如毒液、萼液和畸形細胞均能產生這樣的生理作用[6]，但是，三者對寄主的作用又因種類而存在差異，如菜蛾盤絨繭蜂(Cotesia plutellae)寄生小菜蛾后，寄主不能正常化蛹，3種寄生因子均發揮了關鍵性的作用，單獨注射PDV或畸形細胞和毒液均能抑制寄主化蛹[7]。甲腹繭蜂(Cotesia inanitus)寄生寄主后，寄主不能正常化蛹，畸形細胞只在寄生寄主的初期出現，在這過程中，PDV和毒液起到了主要的作用。

本試驗以寄生蜂產生的毒蛋白對寄主的生長和發育的影響為研究模式體系[8]，為了克服萼液、毒液和幼蜂作用的干擾以及作用劑量的不同，采用假寄生、過寄生和顯微注射畸形細胞的方法，來研究3種毒蛋白對寄主蚜蟲生長發育的影響[9]。可揭示寄生蜂作用于寄主的內部奧秘，并對指導寄生蜂的人工培養利用和害蟲綜合治理以及探索應用生物科技控制害蟲等方面具有重要的理論和實踐價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在遼寧省昆蟲重點實驗室內，通過蘿卜(Raphanus sativus L.)[(溫度(25±2)℃，相對濕度70%～90%，每日光照周期L/D∶14/10(L夜間，D白天)，光照強度3000 Lx的人工氣候培養箱中)]連代擴繁煙蚜繭蜂，羽化出蜂，經鑒定確認后，按雌雄蜂1∶1配對，交配后接種于預先繁殖有200～300頭煙蚜的盆栽蘿卜植株上，進行擴繁[10]。

1.2 試驗方法

1.2.1 被寄生寄主的獲得

將交配過的煙蚜繭蜂20頭移入指形管(Φ=1.5 cm，h=5 cm)內，分別接入 2 齡末、3 齡、4齡初及4齡末若蚜20頭，一次寄生行為發生后，換以未接觸過蜂的同齡若蚜，控制每蜂寄生8～10頭；寄生頭數達到試驗所需，記錄寄生時間；將寄生后的若蚜接入人工氣候箱內隔離的鮮嫩蘿卜葉片上，供試昆蟲在上述條件下飼養。

1.2.2 雌蜂的處理

在無菌操作臺上，用紫外燈光照射交配過的雌蜂100頭3 h(在本實驗室內，進行3次重復試驗，分別對交配過的雌蜂50頭用紫外燈照射0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h 和 4.0 h，然后，分別寄生50頭3～4齡若蚜，結果發現照射3h的雌蜂寄生的蚜蟲的卵孵化率僅為3.6%)，隨后按上述方法讓其寄生2齡末、3齡、4齡初若蚜，每日解剖20頭被寄生各齡期寄主，觀察各處理寄生蜂卵孵化情況。以未經照射處理的正常雌蜂寄生的同齡若蚜做比較，觀察假寄生對寄主若蚜發育的影響，同時以未寄生的同齡若蚜作對照。

1.2.3 畸形細胞的收集

在4℃無菌生理鹽水中解剖寄生5 d已消毒的僵蚜，用毛細吸管將吸入的畸形細胞，置于凹玻片上，經生理鹽水多次沖洗去除寄主血細胞和組織后，再吸入到冰浴中的離心管內，沉淀一定時間后，將上半部分棄去，將沉淀再用生理鹽水沖洗，直至無寄主血細胞及其他組織的殘留，在冰浴中保存立即用作顯微注射。畸形細胞注射前的活性由0.1%中性紅吸收和0.4%臺盼藍排斥進行檢測。

1.2.4 畸形細胞的注射

將100頭4齡的若蚜或假寄生后第7d的4齡若蚜用乙醚麻醉，用顯微注射器將吸入的畸形細胞從蚜蟲腹部注射，每頭蟲注射約1μL，同時注射等量的無菌生理鹽水作為對照。注射后，每日觀察蚜蟲的發育，100頭假寄生寄主被注射后，每日稱量注射后寄主的體重(0.0001 g)，并同時設注射生理鹽水和未經注射的假寄生寄主的體重作為對照。

1.2.5 過寄生與假寄生的獲得

對3齡寄主進行多次 (2～4次)寄生與假寄生，正常寄生1次與多次(2～4次)寄生，每日定時稱量寄主體重，均設同期未寄生寄主的體重變化為對照。以50頭供試若蚜為1個處理，設3次重復；觀察記錄寄主在不同寄生狀態下的生長發育情況，并測量最大寄主的體長和稱取體重。

2 結果與分析

2.1 毒液與萼液和畸形細胞對寄主生長發育的影響

未寄生寄主的發育均快于假寄生和正常寄生寄主，寄生2 d后，正常寄生寄主達到顯著差異水平，到第5 d達到極顯著水平，說明寄生能引起寄主發育的抑制；但從寄生后第7 d起，未寄生寄主已發育成成蚜，假寄生寄主繼續取食發育，最大寄主體重可達0.93 mg，略超過對照未寄生寄主達到成蚜時的最大寄主體重0.91 mg(表1)。若蟲期延長，說明毒蛋白具有抑制若蟲發育的作用；正常寄生后，97.1%的被寄生雌蚜不能進行孤雌生殖，這說明寄生蜂產生的畸形細胞具有抑制生殖的作用；但從假寄生寄主體重的增長趨勢來看，它與正常寄生不同，正常寄生后，寄主體重增長緩慢，這說明是畸形細胞起作用的結果。

表1 寄生對寄主體重的影響

2.2 不同劑量的毒液與萼液對寄主生長發育的影響

對被寄生寄主進行解剖發現，在寄主體內存在蜂卵，說明經紫外燈處理的雌蜂仍能進行產卵寄生，隨著對整個生育期的連續解剖，(96.4±2.8)%的蜂卵不能進行孵化，并且絕大多數的蜂卵未能被寄主的免疫系統所識別而進行血細胞包囊。假寄生的2齡末、3齡和4齡初寄主若蟲期延長，對一次假寄生的寄主而言，毒液與萼液劑量較低，若蟲期延長8～12 d，而多次假寄生的寄主，其劑量成2～4倍增加，當發育到第11 d后，轉化成僵蚜，說明劑量增加對寄生生長和發育有明顯抑制作用。從圖中還可以看到，多次寄生寄主的體重均低于單次寄生寄主的體重，這也說明隨著毒液和萼液劑量的增加，對寄主體重有顯著的影響。

2.3 不同劑量的畸形細胞對寄主生長發育的影響

從圖2中可以看出，多次正常寄生寄主的體重低于單次寄生寄主的體重，說明隨著劑量增加，畸形細胞對寄主抑制作用增強,同時也低于多次假寄生的寄主的體重，說明3種毒蛋白共同作用的結果超過了毒液與萼液的影響。當寄主被寄生2d后，正常寄生的蜂卵即將孵化，同時畸形細胞體積逐漸增大，對寄主的生長抑制更為明顯，而假寄生寄主不存在這種情況。

圖2 四種寄生情況對寄主的影響

2.4 注射活體畸形細胞對寄主生長發育的影響

表2、3所示，注射畸形細胞與注射生理鹽水相比，寄主的體重降低，與未寄生寄主相比，體重增加緩慢，達到的最大體重也低于正常發育的寄主的體重，并從表中能夠看出，因為蚜蟲蟲體較小，注射器傷口造成的寄主死亡率較高。因此，產生寄主體重低的原因可能是畸形細胞和傷口共同造成的。

表2 注射畸形細胞對蚜蟲的生長發育的影響

表3 注射畸形細胞后對寄主體重的影響

3 結論與討論

雌蜂經紫外燈處理后，雖能正常產卵，但產卵不能孵化，采用這種方法造成的假寄生能夠排除蜂卵孵化時釋放的畸形細胞的作用，單獨分析寄生蜂在產卵時注入體內毒液和萼液對寄生蜂的作用。毒液和萼液使寄主蚜蟲取食期延長，發育歷期較未寄生寄主的也長。俞瑞鮮等(2006)[11]提出萼液對寄主的作用是通過毒液而實現的。而正常寄生后，在幼蜂即將結繭化蛹前，寄主停止取食，寄主轉化成僵蚜，這說明有畸形細胞和幼蜂的存在能明顯改變寄主的行為。從該研究結果分析認為，幼蜂的存在是保證畸形細胞發揮作用的前提，首先是保證畸形細胞不被寄主血細胞包囊，之后各因素的協同效應共同抑制寄主的發育，以確定保證幼蜂的發育。曹婷婷[12]得出了用0.05VRE濃度的毒液或0.05FE/μL濃度的毒液和萼液混合物處理離體條件下小菜蛾血細胞就失去了包囊作用。這說明蜂產卵初期由于毒液和萼液的作用，也抑制了寄主免疫系統的作用，使蜂卵進行生長發育，伴隨著蜂卵的生長，產生的畸形細胞開始起到反包囊作用，進而抑制或破壞寄主的免疫系統。我們的研究也發現，單純注射畸形細胞后，寄主體重也呈現下降的趨勢，但下降的趨勢不如正常寄生中3種毒蛋白的影響顯著。

本試驗采用的假寄生較注射的方式有其獨特的優異性，首先它反映的是自然寄生時寄生因子生理劑量的效應，避免了顯微注射人為的機械損傷以及劑量難以控制、生物活性的喪失等因素的干擾，能真正反映寄生因子的生理作用。但對于畸形細胞的研究我們通過與假寄生相結合的方式，一定程度上也能反映正常寄生情況下各種因子的作用。

從我們的研究來看，3種毒蛋白能影響寄主的生長發育，表現在體重降低，若蟲期延長等。有報道稱，多分DNA病毒也對特別是在寄生前期，但到寄生后期，則需畸形細胞的協同作用，共同抑制寄主的生長，以保證幼蟲在完成發育后順利從寄主中羽化出[13]。關于煙蚜繭蜂3種毒蛋白對寄主免疫系統和各種酶的影響將在未來的研究中進一步實現[14]。

[1]劉金文，李建平，叢 斌，等.煙蚜繭蜂畸形細胞發生及發育[J].植物保護，2008，34(1)：62-66.

[2]Hotta M,Okuda T,Tanaka T.Cotesia kariyai teratocytes:growth and development[J].Journal of Insect Physiology,2001(47):31-41.

[3]Norton W N,Vinson S B.Encapsulation of a parasitoid egg within its habitual host:an ultrastructural investigation[J].Journal of Invertebrate Pathology,1977(30):55-67.

[4]Dover B A,Vinson S B.Stage-specific effects of Campoletis sonorensis parasitism on Heliothis virescens development and prothoracic glands[J].Physiol.Ent.,1990(15):405-414.

[5]Stoltz D,Makkay A.Co-replicafon of a reovirus and a polydnavirus in the ichneumonid parasitoid Hyposoter exiguae[J].Virology,2000(278):266-275.

[6]Lawrence P O,Lanzrein B.Hormonal interactions between insect endoparasites and their host insects[J].In:Parasites and Pathogens of Insects. (Backage N E,Thompson S N,Federici B A.Eds.).1993(1):59-86.

[7]白素芬，陳學新，程家安，等.菜蛾盤絨繭蜂多分DNA病毒的特性及其對小菜蛾幼蟲的生理效應[J].昆蟲學報,2003,46(4):401-408.

[8]劉金文，顏秀娟，叢 斌.煙蚜繭蜂畸形細胞對寄主生理代謝的調控[J].中國農學通報,2011,27(9):368-371.

[9]劉金文，李建平，叢 斌,等.協同寄生蜂寄生寄主的因素及其作用[J].安徽農業科學，2006,34(21)：5588-5590.

[10]忻亦芬,李學榮,王洪平,等 .用蘿卜苗作桃蚜植物寄主繁殖煙蚜繭蜂[J].中國生物防治,2001,17(2)：49-52.

[11]俞瑞鮮.菜蛾盤絨繭蜂毒液對寄主小菜蛾生理調控機制的研究[D].浙江大學，2006.

[12]曹婷婷.菜蛾盤絨繭蜂毒液和萼液對寄主小菜蛾幼蟲的免疫調控研究[D].浙江大學，2008.

[13]Johner A,Lanzrein B.Characterization of two genes of the polydnavirus of Chelonus inanitus and their stage-specific expression in the host Spodoptera littoralis[J].Journal of General Virology,2002(80):1847-1854.

[14]Md.Ramjan Ali,Jongbok Seo,Daeweon Lee,et al.Teratocyte-secreting proteins of an endoparasitoid wasp,Cotesia plutellae,prevent host metamorphosis by altering endocrine signals[J].Comparative Biochemistry and Physiology,2013(166):251-262.