14-3-3蛋白家族新機制和新功能研究

賴利平，潘偉男，鄧水秀

(湖南食品藥品職業學院，湖南 長沙 410208)

14-3-3蛋白家族是一組在生物有機體和組織中廣泛表達的、高度保守的、分子量約為25～30KD的酸性蛋白質。根據高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)中5個亞型各自的洗脫位置將哺乳動物腦中14-3-3蛋白的主要亞型命名為α～η，其中α和δ分別是β和ζ的磷酸化形式，另外兩個亞型τ(也稱為θ)和σ分別在T細胞和上皮細胞中表達，τ亞型也在腦等其他組織中廣泛表達，7種亞型均存在于所有真核細胞中。14-3-3作為一個二聚體蛋白家族，調控蛋白質之間的相互作用，廣泛參與細胞信號轉導、周期進程、生長增殖、分化凋亡和擴展遷移。本文就14-3-3蛋白功能、機制的研究進展予以綜述。

1 14-3-3在細胞生長、增殖和分化中的作用

14-3-3通過不同的機制來調控細胞生長、增殖和分化。14-3-3在Raf-1/ERK/MAPK(細胞外信號調節激酶，即促絲裂原激活蛋白)途徑中是通過與Raf-1的相互作用來調控細胞生長的。MAPK信號的級聯放大作用控制著細胞的生長、增殖和分化，包括多種底物和限速步驟。生長因子、激素和絲裂原能促使細胞外信號調節激酶ERK1和ERK2活化，MEK1和MEK2促絲裂原激活蛋白激酶激酶 MAPKK(或稱ERK活化激酶)活化ERK1/ERK2，而Raf-1能活化MEK1/MEK2。Ras作為Raf-1活性的刺激因子，在局部發揮激活的作用，對質膜進行恢復補充。MEK1/MEK2活化后，其將激活MAPK。在此級聯放大的作用下，MEK1/2和MAPK激活潛在的轉錄因子并改變其基因表達方式[1]。14-3-3蛋白調控Raf-1的功能已經明確，但其調控機制非常復雜，仍在繼續深入地研究探討中。Raf的所有亞型中均含有14-3-3蛋白的兩個結合位點，其中一個結合位點是顯性位點或稱為“管理者”位點[2]。在未活化的細胞中，顯性位點是磷酸化的，而另一位點是非磷酸化的。Raf-1并不能促使穩定的Raf/14-3-3相互作用，因此，每個14-3-3二聚體僅通過其中一個結合位點(模序)與靶蛋白結合。當Raf-1的另一結合位點被磷酸化后，在高度局限性的濃縮作用的誘導下，其能與靶蛋白接近并快速結合。研究發現第一個結合位點(模序)定位于Ser 621，即激活Raf-1的重要調節區域，第二個結合模序定位于Ser 259，即抑制Raf-1的重要催化結構域[3]。在未活化的細胞中，Raf-1的Ser 259是未磷酸化的，14-3-3不能結合Raf-1的N端，使Raf-1發揮對質膜的激活作用。當兩個結合位點均被磷酸化后，14-3-3結合Raf-1的N端并引起其構象變化，然而在此過程中14-3-3自身僅有輕微的構象變化。研究結果顯示，14-3-3分離Raf-1從而阻斷其對質膜的恢復作用，并抑制Ras/MAPK途徑[4]。研究發現，apelin-13通過14-3-3/Raf-1復合物-ERK 1/2信號轉導通路促進大鼠血管平滑肌細胞增殖[5]。

14-3-3調控細胞生長和增殖的另一個機制是促絲裂原激活蛋白激酶-1(BMK1)。BMK1是MAPK家族的另一重要成員，其能促進細胞增殖并抑制細胞凋亡，但BMK1的調控機制尚不十分清楚。MEK5是一個逆向作用的激酶，可促使BMK1磷酸化而激活。BMK1活化后使轉錄因子MEF2C磷酸化并被激活，14-3-3β與BMK1調控有關。有研究證實BMK1 C端的Ser 486磷酸化后才能與14-3-3β結合，而且14-3-3β與BMK1結合后可抑制BMK1的磷酸化并阻斷后續的 MEF2C激活作用[6]。另有研究證實，通過BMK1(Ser 486，即定位在BMK1-MEF2C的相互作用位點區域)和14-3-3的相互作用，14-3-3可能競爭性地抑制BMK1與MEF2C結合。因此，14-3-3可通過激活BMK1轉錄因子底物來抑制BMK1。近期研究證實，14-3-3結合p27調控細胞增殖，p27是一個周期依賴性蛋白激酶抑制因子，遷移至核內后抑制周期依賴性蛋白激酶的活性并阻斷細胞周期的進程。因為周期依賴性蛋白激酶是核蛋白，p27定位在細胞核內對其抑制周期依賴性蛋白激酶的活性具有重要意義。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt途徑調控細胞增殖、生存及活性，但過度激活有致癌作用。Akt磷酸化p27定位于Ser 10、Thr 157和Thr 198，p27的Thr 157磷酸化與14-3-3密切相關。在胞漿中14-3-3與p27分離，故能抑制p27的核內功能[7]，最終激活細胞周期蛋白CDK復合物和細胞周期進程。

2 14-3-3在細胞周期調控和細胞凋亡中的作用

14-3-3在細胞周期調控中發揮了較重要的作用。14-3-3與其靶蛋白結合后通過不同的機制影響細胞周期進程，也有可能通過影響蛋白質定位或改變酶活性來影響細胞周期進程。Cdc25C是Cdc25雙重蛋白磷酸酶家族的成員之一，此家族包括 Cdc25A、Cdc25B和 Cdc25C。Cdc25B和Cdc25C已經被證實與CDCK1/cyclin B1復合物(此復合物促使細胞周期從G2期向M期過渡)的激活有關。Cdc25C激活周期依賴性蛋白激酶CDC2，而CDC2經有絲分裂促進細胞生長。Cdc25B的過度表達比Cdc25C更能有效誘發過早的有絲分裂并可導致有絲分裂突變。在分裂間期，14-3-3ε、14-3-3γ與Cdc25C結合可能是通過CDC2抑制過早激活的作用實現的，使得胞漿中的Cdc25C隔離并失活，而Cdc25C通過TAK1激酶和其他未知激酶在Ser 216磷酸化后可與14-3-3ε/γ 結合[8]。此外，CDC2抑制 CDC2激活劑的作用可確保其在有絲分裂開始階段就具有活性。當所謂的“檢查點激酶”CH1K活化時，以相似的機制在DNA損傷后發揮作用。CH1K磷酸化Cdc 25C后，使其與14-3-3蛋白結合，Cdc25C在胞漿中分離開來并使細胞周期停滯在G2期。與之相反，14-3-3σ等另外5種亞型不能與Cdc25C直接結合[8]，14-3-3σ對Cdc25C的間接影響是通過Cdc25C誘導的抑制染色質過早凝聚來完成的，而14-3-3β與14-3-3ε通過相同的調控機制也能抑制Cdc25B。14-3-3還可直接通過影響wee-1酶活性來調控細胞周期。Wee-1是一種酪氨酸激酶，在分裂間期經磷酸化而被激活，其在Ser 642位點磷酸化后與14-3-3蛋白結合并能增強其活性，活化的Wee-1抑制CDC2磷酸化并阻斷細胞周期進程[9]。

14-3-3通過與兩種凋亡前體蛋白Bax和BAD相互作用來調控細胞凋亡。正常情況下，Bax在無活性狀態時位于細胞質中，DNA損傷后，未與14-3-3σ結合的Bax位于中心體周圍的線粒體中，并促使細胞快速進入凋亡過程。然而當14-3-3σ存在時，14-3-3σ通過非依賴性磷酸化途徑與Bax相互作用，兩者結合后Bax在胞漿中處于無活性狀態，阻止細胞進入凋亡過程，最近報道了14-3-3θ與Bax相互作用也有此類似效應[10]。此外，14-3-3通過調節BAD調控細胞凋亡，BAD可以抑制Bcl2和Bclx的抗凋亡作用。在Akt、PKA和核糖體S6激酶-1磷酸化BAD后，BAD可與14-3-3結合。兩者結合后，14-3-3誘導BAD構象變化，使BAD從Bcl2或者Bclx中分離出來，依次阻斷BAD的凋亡前體效應。因此，14-3-3蛋白在阻礙和抑制細胞凋亡中發揮了積極作用，可在細胞損傷至凋亡的一段時間內完成DNA的修復。

3 14-3-3在細胞擴展和遷移中的作用

14-3-3通過整聯蛋白調節機制在調控細胞擴展和遷移中發揮作用。整聯蛋白是細胞表面的糖蛋白家族，其將細胞外基質與肌動蛋白細胞支架相連接。通過跨膜信號轉導的調節，整聯蛋白可以調控細胞擴展、遷移和存活。14-3-3β與β-1整聯蛋白的胞質尾區相互作用，而14-3-3β的過度表達可刺激細胞擴展和遷移。大多數蛋白質是通過依賴性磷酸化或非依賴性磷酸化途徑與14-3-3相互作用的，然而與其他蛋白質不同的是，在依賴性磷酸化或非依賴性磷酸化途徑中，β-1整聯蛋白胞質尾區不與14-3-3的基序結合，β-1整聯蛋白與14-3-3β通過另一種機制結合。最新研究顯示，14-3-3β通過一個新的結合位點與β-1整聯蛋白相互作用，但此作用需要位于14-3-3β兼性凹槽外的helix C Ser60殘基的參與[11]。Ser60磷酸化后可能會阻斷14-3-3β與 β-1整聯蛋白胞漿區的相互作用，促進細胞擴展和遷移。此外14-3-3β可能還通過與Raf-1、p130cas(細胞擴展中有關的微量蛋白)或其他與細胞遷移有關的信號途徑相互作用來促進細胞擴展和遷移。

14-3-3影響細胞擴展和遷移的另一個機制Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)途徑。興奮性細胞內鈣觸發劑多重信號途徑包括CaMK級聯及其下游靶點CaMKⅠ、CaMKⅣ和蛋白激酶B(PKB)。CaMKⅠ位于細胞質中，起到調控mRNA翻譯、細胞支架構建和軸突生長活力的作用。CaMKⅣ位于核內，起調控基因轉錄的作用。此外，在興奮性胞內Ca2+存在的情況下，CaMKⅠ和CaMKⅣ上的磷酸化位點被CaMK激酶(CaMKK)磷酸化后得以激活。最新研究顯示，CaMKK中PKA介導的磷酸化存在三個調節位點，分別為Ser74、Ser108和Ser458，其中Ser108和Ser458磷酸化可使CaMKK失活，Ser74磷酸化后可使CaMKK與14-3-3結合從而抑制CaMKK。此外，CaMKK與14-3-3結合可以阻斷Thr108脫磷酸化作用，使CaMKK處于無活性狀態[12]。

4 結語

盡管在1968年就已經發現了14-3-3蛋白家族，但直到10多年前才有研究發現其特殊作用。最新研究顯示，14-3-3在細胞周期調控、分化、凋亡、擴展、遷移等方面作用顯著，預測未來的深入研究可開啟14-3-3與細胞功能調控復雜關系的密鑰。

[1]SEGER R，KREBS EG.The MAPK signaling cascade[J].FASEB J ，1995(9):726-735.

[2]YAFFE MB.How do 14-3-3 proteins work-Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis[J].FEBS letters，2002(513):53-57.

[3]AVRUCH J，KHOKHLATCHEV A，KYRIAKIS JM，et al.Ras activation of the Raf kinase:tyrosine kinase recruitment of the MAP kinase cascade[J].Recent Prog Horm Res，2001(56):127-155.

[4]DUMAZ N，MARAIS R.Protein kinase A blocks Raf-1 activity by stimulating 14-3-3 binding and blocking Raf-1 interaction with Ras[J].J Biol Chem，2003(278):29819-19823.

[5]PAN WN，LI F，MAO XH，et al.14-3-3 is involved in ERK1-2 signaling pathway of rat vascular smooth muscle cells proliferation induced by apelin-13[J].Progress in Biochem and Biophy，2011(38):1153-1161.

[6]ZHENG Q，YIN G，YAN C，et al.14-3-3β binds to big mitogen-activated protein kinase1(BMK1/ERK5)and regulates BMK1 function[J].J Biol Chem，2004(279):8787-8791.

[7]SEKIMOTO T，FUKUMOTOT M，YONEDA Y.14-3-3 suppresses the nuclear localization of threonine 157-phosphorylated p27kip1[J].EMBO J ，2004(23):1934-1942.

[8]DALAL SN，YAFFE MB，DECAPRIO JA.14-3-3 family members act coordinately to regulate mitotic progression[J].Cell Cycle ，2004(3):672-677.

[9]LEE J，KUMAGAI A，DUNPHY WG.Positive regulation of Wee1 by Chk1 and 14-3-3 proteins[J].Mol Biol Cell，2001(12):551-563.

[10]NOMURA M，SHIMIZU S，SUGIYAMA T，et al.14-3-3 interacts directly with and negatively regulates por-apoptotic Bax[J].J Biol Chem，2003(278):2058-2065.

[11]RODRIGUEZ LG，GUAN JL.14-3-3 regulation of cell spreading and migration requires a functional amphipathic groove[J].J cell Physiol，2005(202):285-294.

[12]DAVARE MA，SANEYOSHI T，GUIRE ES，et al.Inhibition of Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase by protein 14-3-3[J].J Biol Chem，2004(279):52191-52199.