沉默VEGF基因對腺樣囊性癌細胞侵襲的影響*

黃燕婷勞均平

沉默VEGF基因對腺樣囊性癌細胞侵襲的影響*

黃燕婷①勞均平①

目的：利用RNAi技術沉默腺樣囊性癌細胞株ACC-2中VEGF的表達，探討其對腫瘤細胞侵襲能力的影響。方法：利用RNAi技術沉默VEGF表達，用Transwell侵襲實驗檢測細胞體外侵襲能力的變化。結果：與對照組比較，VEGF的siRNA能有效地抑制實驗組ACC-2細胞的侵襲能力。結論：沉默VEGF減弱腺樣囊性癌的侵襲能力。

涎腺腺樣囊性癌； 血管內皮生長因子； RNA干擾； 侵襲

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma， SACC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，約占口腔惡性腫瘤的六分之一。腺樣囊性癌具有嗜神經侵襲以及跳躍性轉移的特點。手術預后差，侵襲以及轉移是患者的主要病因之一[1-2]。

血管內皮生長因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一種強烈誘導血管生成的細胞因子，在腎癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、膀胱癌、子宮內膜癌以及胚胎組織性腫瘤中多有報道。腫瘤組織中VEGF表達水平與惡性程度成正相關，并明顯高于非腫瘤組織[3-4]。這表明VEGF可能通過促進血管形成等方式促進腫瘤的生長，尤其在高度血管化的腫瘤中。VEGF及其受體是血管生成的關鍵因子，其過度表達與腫瘤生長、侵襲及轉移關系密切[5]。

1 資料與方法

1.1 細胞培養 腺樣囊性癌細胞系低轉移株（ACC-2）由中山大學附屬孫逸仙醫院李勁松教授饋贈。兩株細胞培養于10%的FBS、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM培養液，置于37 ℃，5%（v/v）CO2飽和濕度恒溫培養箱中培養。

1.2 siRNA的設計和轉染 VEGF特異性干擾片段參照之前文獻設計。片段序列為：GGCGTCGCACTGAAACTTT，由吉瑪生物合成。

1.3 mRNA的提取和檢測 細胞株的mRNA的提取和cDNA的合成。TRIzol法提取細胞株中總的RNA，cDNA的合成采用M-MLV反轉錄試劑盒（Promega）。VEGF引物的設計如下：VEGF基因：上游引物：5’-GATCCTGCCCTGTCTCTCTG-3’；下游引物：5’-GACTCGCCCTCATCCTCTT-3’。內參GAPDH基因：上游引物：5’-GCCTCAAGATCATCAGCAATGC-3’；下游引物：5’-CATGGACTGTGGTCATGAGTCTT-3’。

1.4 Western Blot檢測VEGF蛋白的表達 分別收集轉染48 h后的ACC-2細胞，用預冷的PBS洗滌，加入蛋白裂解液，提取總蛋白。分別取50 μg蛋白，97 ℃變性后，經10% SDS-PAGE分離，將凝膠置于轉移平衡緩沖液中，再以200 V行電泳跑膠，時間1 h。再以25 V電壓1.5 h將蛋白轉移到PVDF膜上；5%脫脂牛奶（TBST溶解）封閉1 h；10%FBS/TBST加一抗4 ℃孵育過夜；漂洗TBST 3次，10 min/次；10%FBS/TBST加二抗室溫下孵育1 h，漂洗TBST 3次，10 min/次。取等量的ECL發光試劑A、B液，混勻后，孵育硝酸纖維素膜，曝光，以GAPDH為內參。

1.5 Transwell實驗 細胞培養至對數生長期，以無血清的DMEM培養基培養細胞，“饑餓”12 h。消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1～2遍，用無血清DMEM培養液重懸細胞，調整細胞密度至5×105個/mL單細胞懸液。取細胞懸液100 μL加入Transwell小室，設3個復孔。24孔板下室加入450 μL含10%FBS的細胞培養基。細胞培養48 h，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞。采用0.1%結晶紫染色。選擇相同位置的3個視野進行計數。

1.6 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料采用 χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測結果 ACC-2胞中VEGF基因的qPCR以及蛋白產物在轉染后，實驗組與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 VEGF的表達變化

2.2 VEGF表達下調能夠有效抑制腺樣囊性癌細胞的侵襲能力 利用VEGF的siRNA對ACC-2細胞中VEGF的表達進行抑制，利用Transwell實驗檢測ACC-2細胞的侵襲能力的變化。結果顯示：在ACC-2細胞的侵襲能力明顯受到抑制，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 細胞侵襲能力的變化

3 討論

血管內皮生長因子（vasculare endothelial growth factor，VEGF）是一種強烈誘導血管生成的細胞因子，VEGF的表達廣泛見于腫瘤及非腫瘤的病理過程中，它的表達與轉化生長因子B（TGF-β）、血小板源性生長因子（PDGF）、NO以及一些重金屬離子有關，還受缺血和缺氧環境的調節[6]。腫瘤組織中VEGF表達水平與惡性程度成正相關，并明顯高于非腫瘤組織[7]。這表明VEGF可能通過促進血管形成等方式促進腫瘤的生長，尤其在高度血管化的腫瘤中[8-10]。VEGF及其受體是血管生成的關鍵因子，其過度表達能從多方面影響腫瘤的脈管生成，加速腫瘤轉移，與腫瘤生長、侵襲及轉移關系密切[11-12]。本研究通過沉默VEGF基因從而降低ACC-2的侵襲能力。揭示了VEGF的對ACC-2侵襲的調控能力，但針對ACC-2侵襲的調控的具體信號通路還需要做進一步的研究。并且需要做動物實驗驗證，希望以后可以為以VEGF為靶點的惡性腫瘤的生物治療提供理論的依據。

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The Study of the Influence on Invasiveness Activity of ACC-2 Cells Via RNAi VEGF

HUANG Yan-ting，LAO Jun-ping.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：037-038

Objective：To investigate the inhibitory effects of VEGF targeted small interference RNA（siRNA） on invasiveness of salivary adenoid cystic carcinoma（SACC） cell line ACC-2.Method：VEGFsiRNA was transfect into SACC cell line ACC-2 and then examine the changes of invasive ability of ACC-M.Result：The invasive and proliferative abilities of ACC-2 decreased， and the difference between the two groups were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Si-VEGF can effectively decrease invasiveness of SACC cells.

Salivary adenoid cystic carcinoma； Vasculare endothelial growth factor； RNA interference；Invasiveness

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.013

2014-02-17） （本文編輯：黃新珍）

廣東省醫學科研基金（B2011302）

①廣東省佛山市第一人民醫院 廣東 佛山 528000

勞均平

First-author’s address：The First People’s Hospital of Foshan City，Foshan 528000，China