黃藥子配伍甘草對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達影響的實驗研究

華碧春，劉嬌，黃智鋒，史道華，廖華軍，林芳

·藥理毒理·

黃藥子配伍甘草對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達影響的實驗研究

華碧春1，劉嬌1，黃智鋒1，史道華2，廖華軍1，林芳3

目的：研究黃藥子和黃藥子配伍甘草后對大鼠肝臟組織CYP1A2、CYP2E1蛋白表達的影響。方法：將24只雄性SD大鼠分為3組，分別給藥28天，采用HE染色觀察肝組織病理損傷，免疫組化法檢測大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達的情況。結果：黃藥子與甘草配伍能夠改善大鼠肝臟組織病變；與對照組比較，黃藥子組肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白的陽性表達指數明顯升高（P＜0.01）；與黃藥子組比較，配伍組肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白的陽性表達指數降低（P＜0.05或P＜0.01）。結論：甘草能對抗黃藥子導致的肝損傷，其減毒機理可能與抑制肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達有關。

黃藥子；配伍；甘草；免疫組化；CYP1A2；CYP2E1

黃藥子(Rhizoma Dioscoreae)為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨(Dioscorea bulbifera L.)的塊莖[1]。性味苦、辛、涼，有解毒消腫、化痰散結、涼血止血的功效。隨著黃藥子在臨床應用的增加，其臨床不良反應主要表現為對肝臟和腎臟的損害[2]。本課題前期實驗研究發現，黃藥子配伍甘草后可減輕黃藥子肝損傷作用[3～5]。另有研究表明：藥物性肝損傷的發生與肝組織內CYP450的活性水平有密切關系[6]。故本研究采用免疫組化技術分析黃藥子及黃藥子配伍甘草對大鼠肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達的影響，以期了解甘草與黃藥子配伍的減毒機理，為臨床安全、合理使用黃藥子提供科學依據。

1 材料

1.1 藥品及試劑

黃藥子（批號120724）、甘草（批號12030506），購于福建回春醫藥連鎖有限公司，經福建中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為薯蕷科植物黃獨Dioscorea bulbifera L.的干燥塊莖與豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖。CYP1A2抗體(貨號：ab22717)、CYP2E1抗體(貨號：ab19140)購自abcam公司、DAB染色液（鏈霉菌-生物素法）購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2 動物

雄性SD大鼠，體重180～200 g，SPF級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心。

1.3 儀器

HH-4數顯恒溫水浴鍋、TDL80-2B臺式離心機、PYX-DHS-4X50隔水式電熱恒溫培養箱、ZT-14S（雙吊籃）生物組織自動脫水機、YB-6LF生物組織石蠟包埋機、LEICA2235切片機、HFsafe生物安全柜、DM4000B生物顯微鏡。

2 實驗方法

2.1 藥液制備

黃藥子飲片適量，加入8倍量水浸泡60 min，煎煮，煮沸60 min，藥液過濾，藥渣再加入5倍量水，煮沸30 min，合并濾液，濃縮至每毫升相當于1 g生藥，用時稀釋至所需濃度；取黃藥子、甘草飲片（1:2），如上法制備，濃縮至每毫升相當于原藥材1 g（生藥含量以黃藥子計），用時稀釋至所需濃度。

2.2 動物分組、給藥

健康SPF級雄性SD大鼠24只，隨機分為3組，黃藥子組、黃藥子配伍甘草組(后文簡稱“配伍組”)、對照組，每組8只。黃藥子組每日給予黃藥子水煎劑9 g．kg-1（相當于常人最大日用量10倍），配伍組給予27 g．kg-1配伍藥液，對照組給予同體積蒸餾水，連續給藥28天。

2.3 肝組織病理學檢測

大鼠禁食12 h，經10%水合氯醛腹腔麻醉，取適量肝臟組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定，通過石蠟包埋，制成蠟塊。置切片機進行切片，組織切片厚度4 μm，常規脫蠟水化，經蘇木精-伊紅(HE)染后光鏡檢查。

2.4 免疫組化法檢測肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達

采用免疫組化SP法染色，石蠟組織切片經抗原修復，加入相應第一抗體CYP1A2 ( 1:100) 、CYP2E1( 1:200)，加入第二抗體，DAB顯色后檢測蛋白表達量變化。

結果判斷：采用雙盲法觀察切片，每個標本取5個較好的高倍視野（10×40），按顯色范圍分為：①+：顯色范圍占視野＜1/4；②++：顯色占視野1/4～2/4；③+++：顯色占視野2/4～3/4；④++++：顯色占視野＞3/4；顯色程度分弱、中、強，用+、++、+++表示(其中+為1、++為2、+++為3、++++為4)。取其均數為每個檢測指標的最終顯色指數（顯色指數=顯色程度×顯色范圍）。

2.5 統計學處理

3 實驗結果

3.1 大鼠肝臟組織病理學改變

光鏡下觀察對照組大鼠肝小葉結構清晰、完整，肝細胞排列規則、整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀，未見壞死、變性。黃藥子組肝細胞索排列絮亂，肝細胞若干有明顯腫脹，部分細胞質疏松。配伍組肝小葉結構清晰，肝細胞索排列整齊，基本接近對照組。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態學比較

3.2 對肝臟CYP1A2、CYP2E1蛋白表達的影響

大鼠給予黃藥子藥液后，CYP1A2、CYP2E1蛋白表達增強，與對照組比較有非常顯著差異（P＜0.01）；甘草與黃藥子配伍后能夠抑制CYP1A2、CYP2E1蛋白表達，與黃藥子組比較有非常顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。表明甘草具有一定的減毒作用。見表1、圖2。

表1 給藥各組對大鼠肝組織CYP1A2、CYP2E1蛋白表達顯色指數的比較()

表1 給藥各組對大鼠肝組織CYP1A2、CYP2E1蛋白表達顯色指數的比較()

注：與對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與黃藥子組比較，ΔP＜0．05，ΔΔP＜0．01

組別 動物數 CYP1A2 CYP2E1黃藥子組 8 5.74±1.55Δ8.03±2.57**配伍組 7 5.74±1.55Δ4.09±1.18ΔΔ對照組 7 1.86±0.34 1.29±0.32

圖 2 各組大鼠肝組織CYP1A2、CYP2E1蛋白表達情況

4 討論

CYP酶分布廣泛，但主要存在于肝微粒體，參與各種內源性、外源性化合物在體內的代謝過程[7]。同時在藥物的消除過程中起著非常重要的作用，同時也是引起聯合用藥時藥物相互作用產生的主要因素[8]。CYP450家族有多種同工酶，與藥物代謝密切相關有CYP1，CYP2，CYP3三個基因家族。在肝臟中，CYP1A2的含量占CYP450蛋白總量的13%，在藥物代謝、前致癌物激活的過程中均起著重要的作用，它的活性與許多藥物的療效或毒性以及一些腫瘤的易感性密切相關[9]；CYP2E1占CYP450蛋白總量的7%，該酶僅在肝中表達，可以認為是肝的特異性功能酶，它能夠活化前致癌物和毒物，并與肝毒性的發生密切相關[10]。CYP1A2、CYP2E1是CYP450酶系中重要的兩個亞型，具有重要藥物毒理學意義。

有文獻報道：蛋白表達譜變化可能與肝損傷制相關[11]。本實驗采用免疫組化技術檢測CYP1A2、 CYP2E1蛋白表達情況，探討黃藥子配伍甘草的減毒機制。本實驗結果表明：黃藥子組CYP1A2、CYP2E1蛋白表達較對照組明顯增強，配伍甘草后其表達降低。說明甘草的減毒機制之一可能與其抑制CYP1A2、CYP2E1表達有關。肝損傷的發生與質膜損害、自由基損害、線粒體功能失調、代謝紊亂、細胞內離子濃度改變、細胞因子、一氧化氮、免疫變態反應、細胞調亡等有關[12～13]。甘草配伍黃藥子僅通過抑制CYP酶表達減輕毒性作用，還是可能通過更多途徑影響黃藥子對肝臟的毒性作用尚待進一步探討，對深入研究甘草配伍黃藥子的減毒機制有著重要意義。

[1] 唐迎雪.黃藥子古今臨床應用研究[J].中國中藥雜志,1995, 20(7):435

[2] 林厚文,張罡,趙宏斌,等.黃藥子的研究進展[J].中草藥,2002, 33(2):175.

[3] 華碧春,胡娟,王瑞國,等.甘草降低黃藥子致小鼠肝毒性的實驗研究[J].世界中西醫結合雜志,2011,6(1):24.

[4] 華碧春,馬麗娜.黃藥子配伍甘草分煎液與合煎液中黃獨乙素含量的比較[C].第五屆全國臨床中藥學學術研討會論文集,2012:215.

[5] 華碧春,卓實,史道華,等.甘草減輕黃藥子肝毒性的研究[J].福建中醫藥大學學報,2013,23(1):23.

[6] 馬小超,屠曾宏.細胞色素P450在藥源性肝損傷中的作用[J].世界華人消化雜志,2003,11(3):338.

[7] 溫韜,趙金垣.細胞色素氧化酶P450與中毒性肝損傷[J].胃腸病學和肝病學雜志,2007,16(1):82.

[8] 董宇,王階,楊慶,等.CYP450酶與中藥代謝相互作用關系研究概況[J].中國中醫藥信息雜志,2011,18(1):100.

[9] 李菲,程澤能.與細胞色素P4501A2相關的藥物相互作用[J].中國醫院用藥評價與分析,2002,2(2):114.

[10] 廖乃順,陳文列.細胞色素氧化酶P450家族在中藥毒性研究中的應用進展[J].中國藥理學與毒理學雜,2012,26(3):402.

[11] 王坤,金若敏,陳長勛.組學技術應用于藥源性肝損傷的研究述評[J].中醫學報,2012,27(6):731.

[12] 劉樹民.中藥藥物性肝損傷[M].北京:中國中醫藥出版社,2007:15.

[13] 劉丹卓,趙新廣.肝損傷的現代醫學研究進展與展望[J].貴陽中醫學院學報,2007,29(3):50.

（責任編輯：陳思敏）

Experimental study on CYP1A2 and CYP2E1 protein expression in liver of rats by combined administration of Huangyaozi and Gancao

HUA Bi-chun1, LIU Jiao1, HUANG Zhi-feng1, SHI Dao-hua2, LIAO Hua-jun1, LIN Fang3//(1.College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuiian 350122, China; 2.Fujian Provincial Maternal and Child Health Hospital, Fuiian 350001,China;3.Longxi Hospital of Traditional Chinese Medicine, Dingxi 748100, Gansu )

Objective:To study the effects of Huangyaozi used alone and combined with Gancao on the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in rats.Method:24 SD rats were randomized into 3 groups. After 28 days of administration of drugs respectively, the pathological alterations were observed after HE staining, and the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in rats were detected by immunohistochemistry.Result:The compatibility of Huangyaozi and Gancao can amend the liver tissue of rats with lesions. Compared with the control group, the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in the Huangyaozi group were signifcantly increased (P＜0.01).Compared with the Huangyaozi Group, the protein expression of CYP1A2 and CYP2E1 of the liver in the combination group were decreased (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion:Gancao can lower the hepatic injury induced by Huangyaozi. The mechanism may be related to the inhibition of CYP1A2 and CYP2E1 protein expression.

Huangyaozi; combination; Gancao; immunohistochemical; CYP1A2; CYP2E1

R 285.5

A

1674-926X(2014)05-010-03

國家自然科學基金課題（81274105）

1.福建中醫藥大學藥學院， 福建 福州，350122；2.福建省婦幼保健院，福建 福州，350001；3.甘肅省隴西縣中醫院，甘肅 定西，748100

華碧春（1962～），女，教授，碩士生導師，主要從事中藥學研究 Email:1625399195@qq.com

2014-02-25