超早期高壓氧對急性腦外傷大鼠的療效

吳雅麗，薛連璧

（1.首都醫科大學石景山教學醫院 北京市石景山醫院 神經內科，北京 100043；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院 高壓氧科，北京 100050）

伴隨顱腦外傷患者的增多，討論繼發性腦損傷的神經保護治療是當今醫學和社會經濟十分迫切需要解決的課題。適用于這一領域的有希望的方法就是高壓氧治療（hyperbaric oxygen therapy，HBOT）。雖然高壓氧治療已經廣泛應用于臨床，但是它的療效仍存在爭議。本研究采用Feeney自由落體模型造成大鼠中度局灶性顱腦損傷[1]，在損傷后4h進行HBOT，在相應時間點進行進行腦組織含水量和腦組織中核轉錄因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的表達情況的測定，并行HE染色觀察腦組織損傷情況，以分析高壓氧的療效及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康成年雄性SD大鼠24只，220～260g，平均體重250g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗前12h禁食，6h禁水。飼養于12h/12h明暗交替環境，溫度保持（25±1）℃。

1.2 模型制作及分組

采用Feeney法制備大鼠局灶性腦損傷模型，并隨機分為高壓氧治療組（HBOT組）和常壓對照組，各12只。治療組采用上海減壓器廠生產透明純氧動物實驗艙，于模型制備成功后4h內開始高壓氧治療，治療壓力為2個絕對大氣壓（ATA）。升壓20min，穩壓9h，減壓40min。為避免氧中毒，大鼠分別于第1h、3h、5h、7h、9h呼吸純氧，第2h、4h、6h、8h呼吸艙內高壓空氣。對照組大鼠在模型制成后，呼吸常壓空氣。

1.3 腦組織含水量測定

采用干濕重法。高壓氧治療結束后，14h組于外傷后14h將大鼠麻醉后斷頭取腦，3d組于外傷后3d將大鼠麻醉后斷頭取腦，快速取出大腦，用濾紙吸盡腦表面血漬，銳性分離傷側頂葉皮質約200g，用電子天平（萬分之一）稱取樣品濕重，并在110℃烤箱中烘干24h至恒重，稱取樣品干重。通過干濕稱重法計算腦組織含水量，計算公式如下：腦組織含水量（%）=[（濕重-干重）／濕重]×100%。

1.4 病理檢查

全部動物于模型制作成功后，在相應時間點用4%多聚甲醛經升主動脈灌注固定后開顱取腦，將腦組織冠狀切片切為2～3片，4%多聚甲醛固定2h，20%蔗糖溶液中沉淀，3d后取出腦組織，取基底節、海馬層面附近連續冰凍切片，片厚20μm，用免疫組化專用載玻片貼片，常規作HE染色及免疫組織化學染色，按試劑盒說明書操作（中杉金橋生物技術有限公司）。

1.5 NF-κB免疫組織化學染色

實驗試劑：一抗：兔抗大鼠NF-κB（SC-372）：二抗：抗兔抗體試劑盒（pv-9000，中杉金橋生物技術有限公司）；濃縮型DAB顯色試劑盒（1031，福州邁新生物技術有限公司）。具體操作步驟如下：冰凍切片后，以0.01M PBS溶液洗5min 3次；滴加適當稀釋為1：50的兔抗NF-кB抗體工作液，4℃冰箱過夜孵育；次日滴加生物素標記的二抗，濕盒內孵育30min，DAB顯色。以上步驟均經0.01M PBS洗滌3次，蘇木素復染，0.5%鹽酸乙醇分色，飽和碳酸鋰藍化，梯度酒精脫水，封片。

1.6 圖像分析

采用Simple PCI6圖像分析軟件對采集的圖像進行分析，顯微鏡下隨機選取5個視野，測量每幅圖像的陽性細胞的灰度級（Ga）、陽性細胞的面積（n）、背景的灰度級（GA）及背景面積（m）。軟件固定的最大灰度分級（Gmax）為256。應用免疫組織化學計算公式[2]得出陽性單位（PU）：

PU=︳Ga－GA︳×100/{[1－n/（m＋n）]×Gmax}。

1.7 統計學方法

采用SPSS19.0軟件對數據進行統計學處理，2組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 腦組織含水量測定結果

表1示，對照組3d時腦組織含水量較14h顯著擴大，差異有統計學意義（P＜0.05）；組間比較，治療組的腦組織含水量較對照組顯著減小（P＜0.05）。

2.2 光鏡HE染色結果

造模成功后發現挫傷灶周圍皮質、蛛網膜下腔、甚至腦室有不同程度的挫裂傷，有點狀、小片狀出血灶，腦組織膨隆、充血、腫脹，局部可以高出骨窗。光鏡HE染色可見損傷中心為無結構的壞死區，大量紅細胞浸潤，周圍組織疏松淡染，組織間隙增寬。3d時出血較前減少。

2.3 免疫組織化學腦組織NF-κB表達結果

對照組及治療組損傷側的腦組織NF－κB的陽性細胞增多，對照組的更加明顯，主要在損傷周邊區域的神經元表達，同時在膠質細胞表達。應用圖像分析系統和免疫組化定量計算公式計算出PU值，發現損傷后NF-кB均有表達。其中，組間比較，無論在14h還是3d，對照組NF-кB的表達均顯著高于治療組（P＜0.01）。對照組3d時NF-кB表達顯著高于14h（P＜0.01）（見表2）。

3 討論

表1 2組大鼠14h和3d時腦組織含水量比較（xˉ±s，%）

表2 2組大鼠損傷側腦組織NF－κB表達（PU值）（xˉ±s，%）

腦水腫是創傷性腦損傷后重要的繼發性腦損傷，是導致腦損傷死亡和致殘的主要原因，隨著時間的延長，水腫逐漸加重，因此早期防治腦水腫很重要。從本實驗動物腦組織含水量和腦組織鏡下結構結果分析，超早期大劑量HBO單次治療可以減輕腦水腫，在某種程度上抑制或終止繼發性腦損傷的病程進展。HBO治療后，可以迅速有效地改善腦組織創傷腦組織半暗帶區的氧供，防止瀕危組織能量的進一步耗竭。有研究報道稱HBO可降低神經組織缺血損傷后的興奮性氨基酸水平、促進自由基清除劑基因表達、抑制白細胞黏附和再灌注損傷的作用、抑制細胞凋亡和促進內源性神經干細胞增殖等作用[3，4]，從而發揮其腦保護作用[5，6]。但是HBO究竟通過何種機制或者幾種機制抑制甚至終止了繼發性腦損傷的進程，還需要我們進一步研究和探討。

近年來國內外的研究顯示了NF-κB與創傷性腦損傷的關系密切，而且NF-κB在創傷性腦損傷中的作用已經引起廣泛的關注。NF-кB是創傷性腦損傷后被激活的重要核轉錄因子，能夠調節多種細胞因子和炎性介質的表達，與炎癥反應及凋亡密切相關[7～9]。文獻[10]報道，創傷性腦損傷后細胞因子如IL-6等表達增多，而這些細胞因子可以通過NF-κB信號通路的經典途徑激活NF-κB。目前的研究還表明NF-κB的持續表達可以誘導產生大量的TNF-α、白細胞介素等促炎因子，形成惡性循環，加重繼發性腦損傷[11]。孫江紅[12]的研究顯示腦外傷lh后NF-κB開始活化，到24h到達峰值。我們的實驗結果表明：創傷性腦損傷后大鼠損傷側皮層NF-κB表達增強，3d時較14h表達顯著增強，且存在活化現象，但由于我們研究采取的時間點較少，未能發現NF-κB的表達規律。本實驗還發現，經過高壓氧治療干預的大鼠腦組織的NF-κB的表達顯著低于相同時段未接受高壓氧治療的大鼠腦組織，說明高壓氧治療可以降低NF-κB的表達。通過降低NF-κB的表達，減輕繼發性腦損傷，可能是高壓氧治療創傷性腦損傷的可能機制之一。另外本研究還發現，NF-κB在急性創傷性腦損傷后有明顯的核移位現象，即NF-κB陽性細胞在細胞核呈色的同時，細胞漿也顯色，這提示NF-κB在細胞漿內的含量增加，這可能是由于NF-κB的合成增加超過了核內轉運率；也可能是由于本研究應用的NF-κB單克隆抗體對靜息狀態和活化狀態均可標記，所以在陽性細胞的胞漿中也能顯色。今后可結合Western blot方法分別檢測核內及胞漿內NF-κB的蛋白含量或者選用特異性標記活化狀態的NF-κB抗體以進一步證實以上推測。

綜上所述，通過抑制NF-κB生成，減輕腦水腫，發揮腦保護作用是高壓氧治療可能的機制之一。至于高壓氧治療通過何種機制影響NF-κB水平的表達，我們將進一步研究。

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