白藜蘆醇對乳腺癌患者基質金屬蛋白酶9活性的影響

方勇 魏付橋

乳腺癌是女性死亡的第二大死因。盡管其機制尚未闡明，但癌細胞與細胞外基質黏附能力的改變是轉移發生的前提[1]。在這一過程中腫瘤細胞表達和分泌一些蛋白酶如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）分解組織中的基質，從而促進腫瘤的增生與轉移[2-3]。在眾多的MMPs中，其中MMP-9和MMP-2在降解IV型膠原中發揮重要作用[4]。白藜蘆醇是廣泛存在于各類植物中的一種天然多酚，研究顯示其具有多重藥理作用，包括心肌保護，抑制血小板凝集，抗炎、抗氧化作用以及血管舒張等[5]。此外，白藜蘆醇也能通過多種機制調節腫瘤細胞的增殖，侵襲以及凋亡，因此是一種潛在的高效腫瘤預防藥物[6]。本研究旨在觀察白藜蘆醇是否能影響乳腺癌細胞系MCF-7細胞MMP-9的表達，并觀察其抑制效應是否與NF-κB有關。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑 白藜蘆醇和明膠購自購自Sigma-Aldrich公司，抗p 65、PCNA、β-actin抗體購自Santa Cruz。其他分析純產品分別來源于上海生工和AMERCO。Transwell chamber和Matrigel分別購自Costar和Sigma。

1.2 MCF-7細胞培養 人乳腺癌細胞系MCF-7用含10%牛胎兒血清、100 U/mL的青霉素以及100 U/mL的鏈霉素的DMEM培養基（pH 7.4）中在37℃、5% CO2條件下培養。實驗分為陰性對照組和白藜蘆醇處理組 。其中陰性對照組加入等體積培養基，而處理組加入不同濃度的白藜蘆醇在37℃下處理實驗細胞24～72 h。

1.3 Transwell小室檢測MCF-7細胞遷移與侵襲 制備密度為2×106/mL的細胞懸液并加入至Transwell上室。下室加入0.6 mL含20% FBS的培養基及不同濃度的白藜蘆醇。培養結束后取出Transwell小室，計算膜下細胞數。侵襲實驗與遷移類似，不同之處是在Transwell濾膜上鋪上Matrigel。細胞侵襲指數=處理組穿膜細胞數/對照組細胞數。

1.4 明膠酶譜實驗 細胞用無血清培養基培養24 h后，收集上清，加入含1 mg/mL明膠的SDS-PAGE（分離膠10%）。加入含2.5% Triton-X-100復性液孵育30 min以去除SDS。隨后將凝膠用50mmol/L HCl（pH 7.4），5mmol/L CaCl2和1 μmol/L ZnCl2于37℃下孵育過夜。加入0.05%考馬斯亮藍R-250室溫染色30 min，去離子水脫色，拍照，灰度掃描。

1.5 瞬時轉染和熒光素酶報告基因分析 采用pMMP-9-Luc，pNF-κB-Luc報告質粒分析MMP-9和NF-κB轉錄活性。當MCF-7細胞融合度應達到70%～80%時，共轉入0.2μgmmP-9或NF-κB報告基因質粒以及0.2μg pSV-β-半乳糖苷酶并培養24 h。根據試劑盒（Promega）操作步驟，采用光測定儀獲取螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性。裂解細胞后，獲取3次實驗的平均值，以β-半乳糖苷酶活性為內參照，得到標化的螢光素酶活性。

1.6 統計學方法 采用SPSS 15.0 統計學軟件處理數據。計量資料采用均數±標準差（）表示，多組比較采用one-way方差分析并行Student’s t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對MCF-7遷移和侵襲的影響 MCF-7細胞與12.5～100 μmol/L白藜蘆醇孵育24 h后，其遷移率和侵襲力隨著濃度的增加而降低。當白藜蘆醇濃度為50 μmol/L時，其遷移與侵襲率分別降低了34%和30%（見圖1）。

2.2 白藜蘆醇對MCF-7細胞MMP-9活性的影響 明膠酶譜實驗顯示，12.5～100 μmol/L白藜蘆醇孵育24 h后，MMP-9活性隨著濃度的增高而降低，其中白藜蘆醇為100 μmol/L時，其活性降低了 56%（見圖2）。

圖1 白藜蘆醇對MCF-7細胞侵襲和遷移的影響

圖2 白藜蘆醇對MCF-7細胞內MMP-9酶活性的影響

圖3 白藜蘆醇經抑制NF-κB的活性而抑制MMP-9轉錄

2.3 白藜蘆醇通過抑制PMA誘導的NF-κB活性而抑制MMP-9的轉錄

報告基因結果顯示，白藜蘆醇能以劑量依賴性方式抑制MMP-9的啟動子的活性，而NF-κB缺失突變株（-580/+13和-450/+13）啟動子活性輕微受影響（見圖3）。

3 討論

目前臨床用于腫瘤預防與化療的藥物當中，70%來自天然植物。白藜蘆醇是一種生物性很強的天然多酚類物質，大量存在于紅葡萄酒中。此外，花生紅衣與仁中也含有相當多的白藜蘆醇。白藜蘆醇的實驗研究已經證實具有對心血管疾病和癌癥的有益作用[7]。 白藜蘆醇對激素依賴性腫瘤（包括乳腺癌、前列腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌等）有明顯的預防作用[6-8]，但并沒有相關的系統性研究方面的報道。因此，白藜蘆醇確切的抗腫瘤分子機制依然有待進一步研究。在本研究中，我們對白藜蘆醇對MCF-7細胞增殖進行了探討，結果證實：（1）白藜蘆醇能抑制MMP-9的表達與活性；（2）白藜蘆醇能抑制NF-κB的激活從而抑制NF-κB介導的MMP-9的表達而抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲。MMP-9基因轉錄收上游啟動序列的調控，如AP-1、NF-κB以及SP-1等。我們采用突變的報告質粒對MMP-9啟動子活性進行了探討。當NF-κB結合位點突變后，白藜蘆醇對MMP-9的抑制效應消失。這表明NF-κB參與了MMP-9的轉錄過程。而白藜蘆醇通過抑制NF-κB p 65亞基的核轉位，最終抑制MMP-9的表達及酶活性，從而最終抑制MCF-7細胞的轉移。

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