高含量全反式番茄紅素的全合成方法研究

俞伊莎，李珊珊，晏彌卉，陳浙蓉，陳建輝*

（1.紹興文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，浙江 紹興 312000；2.浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 紹興 312500）

番茄紅素（Lycopene）是一種酯溶性不飽和碳?xì)浠衔铮穷惡}卜素的一種，分子式為C40H56，分子量536.85，熔點(diǎn)174 ℃，為針狀紅色晶體；在自然界中多以全反式構(gòu)型（all-trans）的形式存在，廣泛分布于各種植物中，如番茄、胡蘿卜、西瓜、南瓜、紅莓和柑桔等，其中番茄中含量最高，約為3～40 mg/100 g。番茄紅素最早由Harlsen于1873 年從Tamus communis L.berries 中分離出來，1930 年Karrer 等人提出了番茄紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式是由11 個共軛及2 個非共軛的碳碳雙鍵組成的非環(huán)狀平面多共軛雙鍵的結(jié)構(gòu)，并由Kuhn和Grundmann 在1932 年證實(shí)[1]。番茄紅素作為不飽和程度最高的類胡蘿卜素，最近幾年來，在人體健康及疾病防治方面的潛在作用引起了人們越來越濃厚的興趣，研究表明它在抗氧化[2-3]、抗癌[4]、防腫瘤[5]、調(diào)節(jié)免疫功能[6]、保護(hù)心血管[7]和抗疲勞[8]等方面有著優(yōu)越的生理功能，被廣泛應(yīng)用于藥物、食品添加劑和飼料添加劑中。

目前番茄紅素主要制備方法有浸提法[9-10]、微生物發(fā)酵法[11-12]和化學(xué)合成法[13-14]。由于番茄紅素在番茄中含量低，提取工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，浸提法無法滿足市場需求；微生物發(fā)酵法生產(chǎn)周期長、產(chǎn)率低，仍處于小試階段，同樣難以滿足市場對番茄紅素的需求。化學(xué)合成法有生產(chǎn)周期短、成本低和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，近年來受到各國制藥企業(yè)和科研院所的極大關(guān)注。目前采用化學(xué)合成工藝生產(chǎn)番茄紅素主要是Roche 公司和BASF 公司[15-16]，兩家公司都以假紫羅蘭酮為原料，采用Wittig 合成法，合成方式為2C15+C10，兩者的主要區(qū)別是膦鹽的陰離子部分不同。本課題研發(fā)小組對現(xiàn)有的合成番茄紅素路線進(jìn)行總結(jié)，吸收各文獻(xiàn)優(yōu)點(diǎn)，并結(jié)合已有的合成類胡蘿卜素的工作思想和經(jīng)驗(yàn)[17-20]，成功開發(fā)了一種高含量全反式番茄紅素的全合成新工藝，工藝路線如下（合成路線如圖1 所示）：(1)采用弱堿性交換樹脂催化醛酮縮合，用格氏試劑誘導(dǎo)制備六碳醇，再與亞磷酸三乙酯發(fā)生Wittig-Horner 反應(yīng)合成六碳膦酸酯，該路線能夠有效降低六碳醇的合成工藝中丙酮廢水含量，避免了乙炔、液氨及金屬鈣等危險化學(xué)品的使用，安全環(huán)保壓力得以降低；（2）以甲基庚烯酮為起始原料經(jīng)Darzen 反應(yīng)制備九碳醛，與六碳膦酸酯經(jīng)過格氏反應(yīng)，催化氫化，脫水，成鹽得到十五碳磷酸酯，經(jīng)過結(jié)晶手性拆分制備全反式十五碳磷酸酯；（3）2-位雙鍵全反式十五碳膦酸酯通過Wittig-Horner 縮合反應(yīng)直接與十碳雙醛反應(yīng)得到番茄紅素，轉(zhuǎn)位重排制備得到番茄紅素，該工藝路線簡潔，所用原料國產(chǎn)化，所得產(chǎn)物番茄紅素收率較高，具有很大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

圖1 全反式番茄紅素（1）的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Bruker DPX400 型核磁共振儀；上海天美7890F 氣相色譜儀。

所用試劑均為市售分析純，用前不經(jīng)處理。

1.2 合成部分

1.2.1 丁酮醇（2）的合成

堿性樹脂500 g 在2000 mL 去離子水中浸泡24 h，直到樹脂液清澈，過濾。用2000 mL 5%NaOH 水溶液浸泡24 h 以上，過濾。再用去離子水將樹脂洗至中性后，浸泡于1000 mL 去離子水中備用。

裝柱，柱子采用φ80 mm 的夾套保溫柱，夾套通循環(huán)熱水，熱水溫度控制在35 ℃～45 ℃，柱高300 mm。將35%甲醛水溶液與丙酮以1:18（V/V）左右體積比預(yù)先混合好，混合溶液以10 mL/min的速度過柱反應(yīng)；反應(yīng)過程中柱溫控制在35 ℃～45 ℃，下面流出液經(jīng)GC 跟蹤檢測。流出液中的丙酮用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收，回收后的丙酮與甲醛混和后直接套用，蒸發(fā)瓶中的殘留液含有丙酮，丁酮醇，雙丙酮醇和少量雜質(zhì)。目標(biāo)產(chǎn)物丁酮醇經(jīng)連續(xù)精餾可從丙酮、水、雙丙酮醇中分離出來。

1.2.2 甲基乙烯酮（3）的合成

連續(xù)用蠕動泵將上述產(chǎn)物丁酮醇加入500 mL配有蒸餾裝置的三口燒瓶中，外溫控制140 ℃，用蒸餾收集瓶收集丁酮醇的裂解產(chǎn)物甲基乙烯酮和水，加入氯化鈉與無水硫酸鈉進(jìn)行干燥除水，備用。裂解過程中在裂解瓶與收集瓶需加BHT。

1.2.3 六碳醇（4）的合成

在1000 mL 不銹鋼耐壓反應(yīng)釜中，投入鎂粉24.0 g，四氫呋喃500 mL，打開氯乙烯儲罐進(jìn)液閥通入氯乙烯5.5 g，升溫至80 ℃，在60 min 左右緩慢通入氯乙烯57.0 g，在通氯乙烯過程中，觀察釜中壓力不超過0.3 MPa，通畢，在80 ℃～90 ℃繼續(xù)保溫60 min，冷卻至室溫，泄壓，得氯鎂乙烯的THF 溶液。

將上述制備的氯鎂乙烯的THF 溶液轉(zhuǎn)移到3000 mL 四口燒瓶中，放入冷凍浴中，冷至-5 ℃～0 ℃，通入乙炔至飽和，約30 min 滴加甲基乙烯酮70.0 g，控制0 ℃左右，繼續(xù)保溫60 min，在40 ℃以下回收THF，用甲苯夾帶THF，滴加水，用30%硫酸調(diào)pH=3～4，用氯仿萃取，用水洗滌油層二次，加氫醌，維持內(nèi)溫60 ℃～63 ℃，轉(zhuǎn)位反應(yīng)1.5 h。氯仿層用飽和碳酸氫鈉溶液洗至中性，回收氯仿，進(jìn)行粗餾，再精餾，收集60 ℃～65 ℃（1.06 kPa）餾分，即得精品六碳醇70.0 g，收率72.9 %。

1.2.4 六碳膦酸酯（5）的合成

六碳醇70.0 g，亞膦酸三乙酯182.0 g，甲苯100 mL 加熱回流24 h，回收甲苯得六碳膦酸酯（5）157.5 g。

1.2.5 2,6-二甲基-5-庚烯醛（6）的合成

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將126 g（1 mol）甲基庚烯酮和162 g（1.5 mol）氯乙酸甲酯加入到1000 mL 四口瓶中，冷浴保溫-30 ℃左右，滴加30%甲醇鈉的甲醇溶液300 mL，保持-25 ℃以下1.5 h 左右滴完，然后關(guān)掉冷浴，升溫至0 ℃左右加入150 g水，攪拌反應(yīng)0.5 h，再加熱升溫至45 ℃攪拌反應(yīng)1 h。

反應(yīng)液用1200 mL 甲苯分3 次萃取。合并有機(jī)層用300 mL 10% NaCl 水溶液洗滌，MgSO4干燥，過濾，溶劑減壓蒸干后得到2,6-二甲基-5-庚烯醛粗品149.1 g，減壓收集65 ℃～68 ℃/3 mmHg 餾分119.0 g，為淺黃色液體，含量97.1%，收率85.0%。

本反應(yīng)以甲基庚烯酮為原料，與氯乙酸甲酯在堿性縮合劑（甲醇鈉）存在下，經(jīng)Darzens 縮合生成α,β-環(huán)氧酸酯，在溫和的條件下水解，生成游離酸，但很不穩(wěn)定，受熱后，即脫去二氧化碳，轉(zhuǎn)化成比原有反應(yīng)物醛、酮增多一個碳原子的醛、酮。

1.2.6 全反式十五碳磷酸酯（7）的合成

六碳膦酸酯（5）157.5 g 溶于1000 mL 四氫呋喃，2,6-二甲基-5-庚烯醛100.0 g（0.714 mol）甲苯100 mL 溶液冷凍到-20 ℃～-25 ℃左右，滴加氯乙烯格氏試劑的四氫呋喃溶液550 mL（1.6 mol/L），滴加完畢于-10 ℃以下反應(yīng)1 h。加入乙醚1000 mL，和氯化銨飽和水溶液250 mL，過濾，濾液用無水硫酸鎂干燥，蒸除溶劑，加入林德拉催化劑1.0 g[21]，攪拌計量通入氫氣16 L，過濾，得到3,7,11-三甲基-2,4,6,10-四烯十二烷基膦酸二乙酯242.76 g，收率93.6%。1H NMR (δ,ppm,400 MHz,CDCl3):6.741 (t,J=19.6 Hz,1H,C2-H);6.242 (t,J=11.2 Hz,1H,C5-H);5.996 (d,J=11.6 Hz,1H,C6-H);5.628 (t,J=19.2 Hz,1H,C1-H);5.062～5.141 (m,2H,C4-H,C10-H);4.023～4.095 (m,4H,O-C*H2-CH3);3.43～3.53 (m,1H,C3-H);2.056～2.151 (m,4H,C8-H,C9-H);1.825,1.803 (s,3H,C13-H);1.686 (s,3H,C14-H);1.609 (s,3H,C15-H);1.313 (t,J=7.2 Hz,6H,O-CH2-C*H3);1.154 (d,J=6.8 Hz,3H,C12-H)。13C NMR (δ,ppm,400 MHz,CDCl3):156.7 (C2);140.6 (C7);131.7 (C11);129.9 (C4)；125.5 (C6);123.9 (C10);119.4 (C5);114.9 (d,J=186.4 Hz,C1);61.6 (d,J=5.5 Hz,O-C*H2-CH3);40.3 (C8);36.1(d,J=21.1 Hz,C3);26.6 (C9);25.7 (C15);19.7(C13);17.7 (d,J=2.7 Hz,C12);16.9 (C14);16.34,16.28 (O-CH2-C*H3)。

1.2.7 高含量全反式番茄紅素（1）的制備

在氮?dú)獗Ｗo(hù)的250 mL 三頸瓶中加入6.8 g（0.02 mol）3,7,11-三甲基-2,4,6,10-四烯十二烷基膦酸二乙酯和30 mL 8:1（體積比）的四氫呋喃和二甲基亞砜的混合液，機(jī)械攪拌于5 ℃左右（冰水浴）加入2.3 g（0.021 mol）叔丁醇鉀，保溫攪拌2 h，然后于5 ℃左右滴加入10 mL 溶有1.6 g（0.0098 mol）十碳雙醛的8:1（體積比）的四氫呋喃和二甲基亞砜的混合液，約20 min 滴完，繼續(xù)保溫攪拌15 min，將上述溶液升溫于20 ℃～25 ℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢加入100 mL 氯仿，用5%的氯化鈉水溶液洗3 次（每次75 mL），有機(jī)層用硫酸鎂干燥后過濾，濾液減壓蒸去溶劑得番茄紅素粗品。

得到番茄紅素粗品濾餅中加水?dāng)嚢枰韵吹魵埩舻臒o機(jī)鹽類，過濾，烘干。然后將干濾餅轉(zhuǎn)移至300 mL 無水乙醇中，加熱轉(zhuǎn)位異構(gòu)5 h 后減壓回收乙醇。將轉(zhuǎn)位后的番茄紅素粉末真空干燥得到番茄紅素成品3.3 g，含量97%，全反式番茄紅素以C10 雙醛計，收率70%。1H NMR (δ,ppm,400 MHz,CDCl3):5.111,5.975～6.943 (m,8H,雙鍵H);5.11 (m,1H),1.552 (s,6H);1.616 (s,3H);1.689(s,3H);2.129 (s,3H);1.427～2.212 (m,4H)。13C NMR (δ,ppm,400 MHz,CDCl3):139.52 (C5);137.37 (C12);136.56 (C13);136.19 (C9);135.42(C10);132.66 (C14);131.76 (C1);131.58 (C8);130.09 (C15);125.73 (C11);125.17 (C2);124.82(C6);123.96 (C7);40.25 (C4);26.69 (C3);25.72(C20);18.42 (C19);16.97 (C18);12.91 (C17);12.81(C16)。

2 結(jié)論

本課題小組以甲基庚烯酮為起始原料，利用自主研發(fā)新工藝制備六碳醇重要中間體，并采用新方法以九碳醛與六碳膦酸酯制備十五碳磷酸酯，目標(biāo)產(chǎn)物全反式番茄紅素的實(shí)驗(yàn)室收率為70%（以C10 雙醛計），含量97%。同Roche 和BASF 公司現(xiàn)有的番茄紅素生產(chǎn)工藝相比，該路線有效地降低了丙酮的消耗，避免了使用氨基鈣所帶來的大量液氨污染，提高了全反式十五碳膦酸酯的收率，節(jié)約了生產(chǎn)成本，提高了核心競爭力，為全反式番茄紅素的國產(chǎn)化大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

[1]Kuhn R,Grundmann C.Die konstitution des lycppins[J].Ber Deutsch chem Ges,1932,65:80-89.

[2]Di Mascio P,Kaisert S,Sies H,et al.Lycopene as the most eEfficient biological carotenid single oxygen quencher[J].Arch Bichem Biophys,1989,274(1):1-7.

[3]Van K H,Brouwer I A,West C E,et al.Bioacailability of lutein from vegetables is 5 times higher than that of betacarotene[J].Am J Clin Nutr,1999,70(2):261-268.

[4]Giovannucci E,Ascherio A,Rimm E B，et al.Carotenoid and cancer[J].Food Technology,1995,87:1767-1776.

[5]Klein E A,Thompson I M.Update on chemoprevention of prostate cancer[J].Curr Opin Urol,2004,14(3):143-149.

[6]耿姍姍,蔡東聯(lián).番茄紅素對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[J].中國臨床康復(fù),2005，9(27):148-149.

[7]Rao A V,Agarwal S.Tomato lycopene and low density lipoprotein oxidation:a human dietary intervention study[J].Lipids,1998,33(10):981-984.

[8]李軍漢，周進(jìn)，黃雷.番茄紅素的生物學(xué)特性及其在體育運(yùn)動領(lǐng)域的應(yīng)用[J].吉林體育學(xué)院學(xué)報,2009，25(4):64-65.

[9]Mark L.Evaluation of extraction method for the analysis of carotenoids in fruits and vagetables [J].Food chem,1998,63(4):577-84.

[10]趙京城.高純度番茄紅素的制備方法:CN,ZL02146560.6[P].2003-03-26.

[11]DSM IP 資產(chǎn)有限公司.無外源胡蘿卜素生成抑制劑條件下培養(yǎng)基中生成高產(chǎn)量番茄紅素的三孢布拉霉：CN,ZL02821563.X [P].2007-08-08.

[12]薛嬌.番茄紅素的一種新型生成途徑-Erwina.Herbicola的crtI 基因在Rhodobacter Sphaerodies 中表達(dá)[D].重慶:重慶大學(xué),2008.

[13]Karrer P,Eugster C H,Tobler E.Synthesen von carotinoidfarbstoffen III.totalsynthese des lycopins [J].Helv.Chim.Acta.,1950,33(5):1349-1352.

[14]Isler O.Synthese voncrocetindialdhyd und lycopin[J].Helv.Chim.Acta.1956,4:463-473.

[15]Hoffmann-La Roche Inc.Method for the manufacture of carotinoids and novel intermediates:US,5166445 [P].1990-01-11.

[16]BASF Aktiengesellschaft.Preraration of phosphonium salts:US,6187959B1[P].1998-08-07.

[17]南京工業(yè)大學(xué),浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠.2,7-二甲基-2,4,6-辛三烯-1,8-二醛的合成方法：CN,103172504 A[P].2013-06-26.

[18]南京工業(yè)大學(xué),浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠.3,7,11-三甲基十二碳-2,4,6,10-四烯-1-基膦鹽的制備方法：CN,103172673 A[P].2013-06-26.

[19]浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠.全反式假性紫羅蘭酮的制備方法：CN,102070424 B[P].2013-05-10.

[20]浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠.(e)-假性紫羅蘭酮的制備方法：CN,102070423 A[P].2011-05-25.

[21]Isler O,Gutmann H,Lindlar H,et al.Synthesis in the carotenoid series.VI.Synthesis of crocetin dialdehyde and lycopene[J].Helv Chim Acta,1956,39(1):463-473.