MTT法檢測幾種多糖和寡糖的體外細胞毒性

劉 凱，朱麗敏，許寶青，劉新軼，謝 楠，王宇希，馬恒甲

（浙江省杭州市農業科學研究院,浙江杭州 310024）

MTT法檢測幾種多糖和寡糖的體外細胞毒性

劉 凱，朱麗敏，許寶青，劉新軼，謝 楠，王宇希，馬恒甲

（浙江省杭州市農業科學研究院,浙江杭州 310024）

選用HL7702正常肝細胞系為靶細胞,用含不同濃度的多糖和寡糖的細胞培養液,通過MTT法進行細胞毒性檢測并評價多糖和寡糖的細胞毒性。結果表明,Zymosan A、β-glucan、Lam inarin和酵母細胞壁具有一定的細胞毒性,茶多糖、香菇多糖、黃芪多糖和海藻多糖等對細胞毒性較小,其中海藻多糖對細胞生長具有明顯的促進作用。低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖和水蘇糖等4種寡糖在低濃度時均無毒性,在高濃度時低聚異麥芽糖具有一定的細胞毒性,而水蘇糖表現出明顯的劑量依賴性。

MTT法；細胞毒性；多糖；寡糖

功能性寡糖在飼料工業上稱為益生素或益生元,由于其結構穩定,存貯方便,無毒、無害、無殘留,作為一種新型的綠色飼料添加劑日益受到重視［1-2］。自20世紀60年代以來,世界各國開始對多糖進行了廣泛的研究,認為其具有增強非特異性免疫的功能［1,3］。目前國內外魚用免疫增強劑的研究比較活躍［1-4］,也普遍認為其對魚體能起到免疫增強的作用。根據對甲殼動物上的研究結果, Smith等［5］就免疫增強劑能否增強機體免疫功能提出了謹慎的觀點,并試驗證實葡聚糖等免疫增強劑具有細胞毒性［6］。本試驗就此對幾種常見的寡糖和多糖等非營養性飼料添加劑,采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）進行了體外細胞毒性試驗,以期豐富糖類非營養性飼料添加劑研究的內容。

l 材料與方法

1.1 試驗用多糖和寡糖

Zymosan A（純度＞99%,Wako）是從酵母細胞壁或酵母細胞提取的一種富含葡萄糖甘露糖的多糖。β-glucan（純度＞99%,Wako）提取自啤酒糖酵母菌。Laminarin（純度＞99%,Sigma）提取自褐藻掌狀海帶,為單純葡萄糖的聚合物。免疫多糖（即酵母細胞壁、酵母多糖）（山東濟寧生物科技有限公司）,富含葡聚糖（含量在20%以上）等多糖。低聚異麥芽糖（純度＞90%）、低聚果糖（純度＞95%）、低聚木糖（純度＞95%）、水蘇糖（即大豆低聚糖,純度＞99%）、茶多糖（純度＞99%）、香菇多糖（純度＞96%）、黃芪多糖（純度＞95%）、海藻多糖（純度＞95%）（國產,杭州捷程生物科技有限公司）。

1.2 受試細胞株

HL7702正常肝細胞系（湖南湘雅醫學院）培養于培養皿或培養瓶中；完全培養基為DMEM,含10%胎牛血清,置于5%CO2,37℃培養箱中培養。傳代比例1∶3,胰酶消化。

1.3 試劑、儀器與測定

MTT、DMSO（Sigma）；DMEM培養基（Gibco）；胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液（四季青）；細胞培養皿、細胞培養瓶、96孔板和酶標板（Corning costar）。

酶聯免疫檢測儀（上海科華試驗系統有限公司）,倒置顯微鏡（日本Olympus有限公司）,CO2恒溫培養箱（日本Sanyo公司）,電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司）,移液槍（德國Eppendorf公司）,液氮貯存罐（樂山亞西機器廠）,超凈工作臺（蘇州集團安泰空氣技術有限公司）。

1.4 MTT檢測細胞活性

樣品設10個劑量組（10,20,40,80,160, 320,640,1 280,2 560和5 120μg·m L-1）。取處于對數生長期,生長狀態良好的細胞10萬個接種至96孔板,每組設3個復孔,另外設陰性對照組（0μg·mL-1）和空白對照組。待細胞貼壁6～8 h后,按照設定濃度添加到細胞中。37℃,5% CO2培養箱中繼續培養24 h后檢測細胞活性,細胞活性以細胞相對增值百分率（RGR,relative growth rate）表示。

RGR/%=（試驗組D值/陰性對照組D值）× 100,根據每組的細胞增值百分率,按表1轉換為0～5級毒性分級評價［7-8］。

表1 細胞相對增值率與細胞毒性分級的關系

1.5 數據處理

采用WPSOffice 2013和SPSS 13.0 for W indows軟件進行數據統計,所有數據以平均值±標準誤差表示,P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

從表2可見,不同濃度的低聚果糖和低聚木糖對細胞生長表現出先促進而后逐漸抑制的趨勢,當其濃度為10μg·m L-1時,顯著促進細胞的生長；而當其濃度超過80μg·mL-1后,則其對細胞生長影響與對照組無顯著差異。水蘇糖對細胞的生長影響隨著濃度的遞增而增強,當其濃度達到160 μg·m L-1以后,則顯著促進細胞生長。低聚果糖、低聚木糖和水蘇糖對細胞毒性的評價等級始終在0～1級。低聚異麥芽糖對細胞的生長無明顯的促進作用,當其濃度低于80μg·m L-1時,對細胞生長無明顯影響；但達到80μg·m L-1后,則明顯抑制細胞生長；而濃度達到1 280μg·m L-1后,其毒性評價等級即降到2級。

Zymosan A、β-glucan和Laminarin等3種多糖對細胞生長均未有明顯的促進作用。其中Lam inarin濃度達到20μg·m L-1后,則明顯抑制細胞的生長；β-glucan濃度達到10μg·mL-1時,即明顯抑制細胞的生長；Zymosan A則在濃度為80μg·m L-1以下時,對細胞生長無明顯影響,而當濃度達到160μg·m L-1后,明顯抑制細胞的生長。由于Zymosan A溶解性差,640μg·m L-1以上濃度不溶,因此結果可能受到影響。以上3種多糖的細胞毒性評價在0～2級。酵母細胞壁對細胞生長的影響與β-glucan類似,濃度達到10μg·m L-1時即明顯抑制細胞的生長,其細胞毒性評價等級為1～2級。茶多糖在濃度達到10μg·m L-1時,明顯促進細胞的生長；當達到2 560μg·m L-1后,無明顯的促進作用,其細胞評級在0～1級。黃芪多糖在濃度低于640μg·m L-1時,對細胞生長無明顯作用；濃度達640～2 560μg·m L-1時,對細胞生長具明顯的促進作用,此后明顯抑制細胞的生長。其細胞毒性評級在0～1級。香菇多糖對細胞生長的影響與黃芪多糖類似,但其濃度在80～640μg·m L-1時,對細胞生長具有明顯的促進作用,其細胞毒性評級在0～3級。海藻多糖在濃度為10～5 120μg·m L-1時,對細胞生長均有明顯的促進作用,其細胞毒性評級均為0級。

3 小結與討論

活細胞特別是增殖的細胞中能量代謝旺盛,其中線粒體能量代謝過程中產生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的四甲基偶氮唑鹽還原成藍紫色的不溶性的甲瓚,沉積在細胞內和細胞周圍,然后用酸化異丙醇溶解。死細胞則無此功能,無甲瓚的形成,凋亡細胞的甲瓚形成能力也降低,表現為吸光度降低。根據對MTT轉化能力的高低可判斷細胞的存活情況,也可了解組織、細胞的代謝狀態。通常組織、細胞代謝活躍時,MTT轉化能力較高。目前檢測細胞數的常用方法也用［3H］脫氧胸苷攝入法反映細胞的DNA合成。由于DNA合成與細胞的能量代謝密切相關,而MTT法反映細胞的能量代謝,兩種方法的結果一致,用MTT法代替［3H］脫氧胸苷攝入法同樣可得到滿意的結果,且MTT法穩定客觀,沒有放射性損傷和污染問題［9］。

Zymosan A、β-glucan和Laminarin等均為國外研究較多的不同來源和類型的葡聚糖［1,3］,免疫多糖或稱酵母多糖、酵母細胞壁,是目前國內研究較多的一種免疫添加劑［1,3］,其主要成分均為葡聚糖。從本研究結果看,這幾種免疫增強劑均具有一定的細胞毒性,這與Hauton等［6］在甲殼動物上的研究結果類似,表明這幾種免疫增強劑在使用時一定要注意添加劑量,添加量過高會對機體產生一定的傷害。

茶多糖、香菇多糖、黃芪多糖和海藻多糖等也

是國內近年來研究較多的多糖類添加劑［1,2］。從本試驗結果來看,這幾種多糖的細胞毒性均較小,且其中海藻多糖對細胞生長具有明顯的促進作用。已有報道表明其作為飼料免疫添加劑對動物生長具有明顯的促進作用［10-11］。

表2 幾種多糖和寡糖體外細胞毒性測定結果

低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚木糖和水蘇糖是4種主要的功能性低聚糖,目前已廣泛用于飼料與食品工業［1-2］。這幾種寡糖低濃度時對細胞均無毒性,毒性評價等級0～1級,其中水蘇糖對細胞生長表現出明顯的劑量依賴性,而低聚異麥芽糖在高濃度時表現出一定的細胞毒性,因此在使用中添加量不應過高。

［1］ 咼于明.動物免疫營養［M］.北京：科學出版社, 2011：138-169.

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［11］ 于會民,陳寶江,田亞東.海藻多糖及其作為飼料添加劑的應用試驗［J］.養殖技術顧問,2006（6）：18-19.

（責任編輯：張瑞麟）

S 91

A

0528-9017（2014）03-0421-04

文獻著錄格式：劉凱,朱麗敏,許寶青,等.MTT法檢測幾種多糖和寡糖的體外細胞毒性［J］.浙江農業科學,2014（3）：421-424.

2013-11-13

杭州市科技局科技計劃項目（20120232B07）；浙江省水產農業新品種選育重大科技專項（2012C12907）；杭州市財政專項

劉 凱（1982-）,男,碩士,從事水產養殖方面研究工作。E-mail：liukai0106@hz.cn。