生化黃腐酸對3種腫瘤細胞體外增殖影響的初步研究

高金崗 陳沫 何濱

(海南師范大學生命科學學院熱帶動植物生態學省部共建教育部重點試驗室 海口 571158)

生化黃腐酸對3種腫瘤細胞體外增殖影響的初步研究

高金崗 陳沫 何濱

(海南師范大學生命科學學院熱帶動植物生態學省部共建教育部重點試驗室 海口 571158)

本試驗采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法，研究了生化黃腐酸對3種腫瘤細胞(人胃癌細胞株SGC、人肝癌細胞株SPCA和人肺癌細胞株BEL)在體外增殖的影響。在3種不同腫瘤細胞培養液內分別加入6種不同濃度的生化黃腐酸，用酶標儀測定3種不同培養腫瘤細胞的吸光值(OD值)，計算生化黃腐酸對3種不同腫瘤細胞的抑制率。試驗結果表明：在各個濃度下，生化黃腐酸對3種不同腫瘤細胞的抑制率均低于50%，屬于非敏感型藥物。生化黃腐酸對腫瘤細胞的體外增殖沒有明顯的直接抑制作用，且在某種濃度下，生化黃腐酸可能對腫瘤細胞有促進生長的作用。

生化黃腐酸 腫瘤細胞 MTT法 細胞體外增殖

腫瘤是危害人類健康的惡性疾病之一。近幾年來，腫瘤患者的病死率有上升趨勢[1]。抗腫瘤藥物在抑制癌細胞的同時，也會損害人體的正常細胞。由于化療藥物的毒副作用大，且易產生耐藥性。因此，尋找敏感、毒副作用小的抗腫瘤藥物就顯得非常必要。

生化黃腐酸(Biotechnology Fulvic Acid，簡稱BFA)是以作物秸稈等有機物為主要原料，經過微生物發酵而產生的以黃腐酸為主要成分且含有多種生物活性物質的復合物[2]。其來源天然，毒副作用極小，長期使用不會產生耐藥性[3，4]。

有報道認為，BFA作為飼料添加劑能明顯提高動物的抗炎能力[5，6]。臨床試驗也證明，黃腐酸鈉在止血、抗炎、止痛和調整腸胃功能等方面具有重要作用[7]。張覃沐等[8]報道，煤炭黃腐酸對小鼠體內腫瘤細胞有一定的抑制作用，而對體外培養的小鼠艾氏腹水癌細胞(ECA)無明顯毒性作用。關于BFA是否對體外腫瘤細胞有直接的影響作用尚未見報道。因此，本文以人胃癌細胞株SGC、人肝癌細胞株SPCA和人肺癌細胞株BEL共3種腫瘤細胞為研究對象，初步研究了BFA對腫瘤細胞體外增殖的影響，以探討BFA對腫瘤細胞的生長是否具有直接的抑制作用，從而為BFA的臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試細胞株

人胃癌細胞株SGC、人肝癌細胞株SPCA和人肺癌細胞株BEL，均購自中科院上海細胞庫(ATCC)。

1.2 試驗儀器

倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；酶聯免疫檢測儀(華東電子集團醫療裝備有限公司)；CO2恒溫培養箱(日本SANYO公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；立式超低溫冰箱(丹麥Heto公司)；高壓滅菌鍋(日本森展企業有限公司)；可調式移液器(BRAND公司)；96孔細胞培養板(Pore公司)等。

1.3 試驗藥品及處理方法

1.3.1 試驗藥品

BFA(購自上海通微生物技術有限公司，棕褐色粉末，BFA含量≥95%)；胰蛋白酶(購自Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT，購自Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，購自天津市化學試劑二廠)；RPMI-1640培養基(購自Gibeo公司)；優級新生胎牛血清(購自蘭州民海生物工程有限公司)；80萬單位的青霉素和100萬單位的鏈霉素(均購自海南醫學院附屬醫院藥劑室)。

1.3.2 藥品處理

(1)RPMI-1640血清培養基：RPMI-1640血清基礎培養基1袋，NaHCO33.7 g，用1000mL三蒸水溶解，磁力攪拌，調pH=7.5。

(2)胰蛋白酶(0.25%)：胰蛋白酶0.5 g，三蒸水200mL，磁性攪拌，待完全溶解后，用直徑為0.22μm雙層濾膜過濾除菌，-20℃保存。

(3)PBS緩沖液：NaCl 8.0g(pH 7.2～7.4)，KCl 0.2 g，NaH2PO41.44 g，KH2PO40.24 g，三蒸水1000mL，高壓滅菌，室溫保存。

(4)胎牛血清：-20℃保存，取出室溫融化，之后，放入56 ℃恒溫槽中，恒定30min滅活，分裝，-20℃保存。

(5)抗菌素液(雙抗液)：用注射器吸5 mL PBS，注入鏈霉素(100萬單位)瓶內，反復吹打，使其完全溶解，然后吸出4 mL再注入青霉素(80萬單位)瓶內，反復吹打，使其完全溶解。吸出全部于一小燒杯，加PBS至100mL，在超凈臺內用過濾器分裝，每瓶5 mL，20℃保存備用。

(6)MTT溶液：MTT 50mg，加PBS 50mL，攪拌溶解，用直徑為0.22μm的濾膜過濾除菌后，4 ℃避光保存，一周內使用。

1.4 試驗方法

1.4.1 凍存細胞的復蘇

從液氮罐中取出凍存的SGC、SPCA和BEL細胞株，迅速放入37 ℃水浴中，使其在1 min內完全溶解，將細胞懸液移至離心管(內裝含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液)中，在4 ℃、1000rpm/min下離心3 min，棄上清液，將細胞重新懸浮于RPMI-1640培養液(內含10%胎牛血清)中，置于37 ℃的CO2培養箱內培養，24 h后觀察細胞貼壁情況，并更換一次培養液。

1.4.2 細胞培養

將凍存復蘇的3種細胞株分別裝在有適量RPMI-1640培養液(內含10%胎牛血清和雙抗液)的培養瓶中，置于CO2培養箱中，在恒溫37 ℃、5% CO2濃度、飽和濕度下培養。

每3～4天傳代一次，傳代時小心棄去舊培養液，用PBS緩沖液(pH7.4)沖洗2次，棄去PBS緩沖液，加入適量0.25%胰蛋白酶，37 ℃，消化1～2 min，倒置鏡下觀察細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度，加RPMI-1640培養液(內含10%胎牛血清)終止消化，用吹打管將已經消化好的細胞吹打為細胞懸液。將細胞懸液由細胞培養瓶中吸入離心管中，1000rpm/min離心5 min；離心后棄去上清液，再加入新鮮的RPMI-1640培養液(內含10%胎牛血清)，用微量進樣器輕輕反復吹打細胞懸液，使細胞重懸混勻后，分裝于培養瓶中再培養。

1.4.3 細胞凍存

在細胞培養的過程中，防止試驗過程中操作不當造成細胞完全死亡，可以將一部分細胞凍存起來。凍存細胞時選用對數生長期細胞。凍存方法如下：將細胞制成細胞懸液，計數、離心、去上清，加入含10%二甲基亞砜(DMSO)的凍存液，用吸管輕輕吹打使細胞重懸，使細胞密度達到5×106個/毫升，分裝入無菌凍存管中，先在4 ℃條件下放置45 min，然后置于-20℃再放置45 min，最后在-80℃下過夜，逐級降溫冷凍，然后放入液氮罐中保存。

1.4.4 細胞鋪板

鋪板前處理：將對數生長期的細胞經0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單個懸浮細胞，用血球計數板計數，將結果代入下式：細胞個數/毫升原液=(四角大格中細胞數之和/4)×104，接著用RPMI-1640培養液調整細胞的濃度，使SGC細胞的濃度達4×104個/毫升，SPCA細胞濃度達2×104個/毫升，BEL細胞濃度達7×104個/毫升。

將調整好濃度的3種細胞分別加入到96孔細胞培養板B行到F行中，每孔180μL，鋪兩行吹勻一次，A行每孔加200μL RPMI-1640培養液作為空白對照，分別置于37 ℃、CO2培養箱培養。

1.4.5 藥品溶解及稀釋

用電子天平稱量BFA100mg，在超凈臺內用1 mL的DMSO溶解，待溶解后用移液器混勻，將母液稀釋成不同的濃度，分別為：0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、100mg/mL。將6個濃度的BFA藥品分別依次加入到96孔細胞培養板的D、E、F行中；A行設置空白組(僅加入不含細胞的培養液)，B、C兩行是對照組(以培養液替代藥物)，然后置于37 ℃、5% CO2濃度培養箱中培養。各濃度BFA在96孔細胞培養板上的安排見表1。

表1 細胞板上各孔的濃度Tab.1 The concentration of each hole on the cell board

1.4.6 MTT法[9]測吸光值(OD值)

加藥44 h后，向3個細胞板中分別加入MTT溶液，每孔50μL。4 h后，將培養板中培養的3種細胞的液體倒掉，加入DMSO，每孔150μL，震蕩10min，使用酶標儀在570nm波長下測定各孔OD值。

根據抑制率公式[10]：抑制率(%)=(對照組OD值-試驗組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%，分別計算不同濃度的BFA對3種腫瘤細胞的抑制率。

各項試驗均重復3次以上，用統計學軟件SPSS處理。試驗組與對照組間采用獨立樣本t檢驗法，以P＜0.05為差異具有顯著性意義。

2 結果與分析

2.1 BFA對3種腫瘤細胞的影響

根據上述抑制率公式，分別計算不同濃度的BFA對3種腫瘤細胞的抑制率，繪制抑制率曲線，見圖1～圖3。同時，依據吳舟鋒[11]使用的判斷藥物是否是腫瘤細胞敏感型藥物的標準(抑制率＜50%為不敏感；50%～70%為中度敏感；＞70%為高度敏感)進行判斷。

圖1 生化黃腐酸對SGC的影響Fig.1 The in fl uence of biochemistry fulvic acid on SGC

由圖1可見，不同濃度BFA對SGC的抑制率不同。在0.1～1 mg/mL濃度范圍內，抑制率表現為逐漸下降趨勢；在1～10mg/mL濃度范圍內則表現為逐漸增加，至10mg/mL濃度時達到40.96%抑制率，接近最大抑制率(約42.50%)；之后又逐漸減少。各濃度BFA對SGC細胞的抑制率均未達到50%。

圖2 生化黃腐酸對SPCA的影響Fig2. The in fl uence of biochemistry fulvic acid on SPCA

由圖2可見，不同濃度BFA對SPCA的抑制率不同。在0.1～1 mg/mL范圍內，抑制率表現出明顯地下降趨勢，至1 mg/mL時，抑制率為負值；而在1～10mg/mL范圍內，抑制率則表現為逐漸增加趨勢，至10mg/mL濃度時，抑制率達到8.53%，接近最大值(約8.85%)；之后，隨著濃度增加，抑制率又逐漸降低，當濃度為50～100mg/mL時，抑制率變化趨于平穩，但均為負值。各濃度的BFA對SPCA細胞的抑制率遠未達到50%。

圖3 生化黃腐酸對BEL的影響Fig.3 The in fl uence of biochemistry fulvic acid on BEL

由圖3可知，不同濃度BFA對BEL的抑制率不同。在0.1～1 mg/mL濃度范圍內，抑制率表現為小幅增加趨勢；而在1～5 mg/mL濃度范圍內，則表現為下降趨勢；當濃度為5～10mg/mL時，抑制率又逐漸增加，至10mg/mL濃度時，抑制率達到9.48%，接近最大值(約9.90%)；之后，隨著濃度的增加，抑制率大幅度下降，在50～100mg/mL濃度范圍內，抑制率均為負值，當濃度達到中100mg/mL時，抑制率約為-54.93%。各濃度BFA對BEL細胞的抑制率均未達到50%。

2.2 BFA對3種腫瘤細胞抑制結果的分析

為了進一步判斷BFA對3種腫瘤細胞體外增殖的抑制作用，根據各濃度試驗組所得OD值與對照組OD值進行差異顯著性分析，結果見表2。另外，計算出的抑制率也放入表2，用以對BFA的抑制作用進行輔助分析。可見，SPCA細胞組中6個濃度試驗組與對照組相比均沒有顯著差異(P＜0.05)，表明BFA對SPCA細胞沒有抑制作用。而SGC細胞組中，有3個濃度(5 mg/mL、10mg/mL和50mg/mL)與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)或極顯著性差異(P＜0.01)；BEL細胞組中，有2個濃度(50mg/mL和100mg/mL)與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)或極顯著性差異(P＜0.01)，但這5個試驗組對SGC和BEL細胞的抑制率都低于50%，表明BFA對這2種腫瘤細胞也沒有明顯的抑制作用。

表2 BFA對3種不同腫瘤細胞的抑制作用(n=6)Tab.2 Anti-proliferative activity of biochemistry fulvic acid on three tumor cells(n=6)

3 結論與討論

本試驗結果表明：BFA對3種腫瘤細胞的體外增殖沒有明顯的直接抑制作用。

在濃度達到10mg/mL時，BFA對SGC的抑制率達到40.96%，其最大抑制率約為42.50%(圖2)，接近了50%的抑制率。統計學處理結果也表明：BFA對SGC具有抑制作用，其中有3個濃度(5 mg/mL、10mg/mL和50mg/mL)試驗組與對照組相比有顯著性差異。BFA對SGC的體外生長可能有一定的影響，但由于BFA的3個濃度的抑制率均小于50%，沒有明顯抑制腫瘤細胞增殖的作用；而BFA對SGC和BEL兩種腫瘤細胞抑制率更低，6個濃度的抑制率均未達到10%。因此，認為BFA不是腫瘤細胞敏感型藥物，對癌細胞本身沒有直接的抑制或殺滅作用。

張覃沐等[8]報道，煤炭黃腐酸對體外培養的小鼠艾氏腹水癌細胞(ECA)無明顯毒性作用；而在體內對小鼠腫瘤細胞有一定的抑制作用，且口服比注射效果要好。他們認為，煤炭黃腐酸可能是通過提高小鼠自身免疫系統的功能而發揮其抗腫瘤作用的，而不是直接抑制或殺滅腫瘤細胞，本研究結論支持此觀點。

本試驗結果還顯示：當BFA的濃度較高(＞50mg/mL)時，對SPCA和BEL細胞株的負面影響很小(圖2和圖3)：抑制率很低，甚至出現負值。由此推測：因為BFA具有一定的抑菌作用[12]，又含有多種營養成分，在體外腫瘤細胞培養體系中，加入一定濃度的BFA，可能有益于細胞的增殖，有促進細胞生長的作用。

雖然本試驗結果表明BFA不是腫瘤細胞敏感型藥物，對腫瘤細胞本身沒有直接的殺滅作用，但由于BFA來源于天然，毒副作用很小，長期使用不易產生耐藥性,在確定有效活性組成后，BFA有可能作為腫瘤患者化療時的輔助用藥使用，提高腫瘤患者的免疫力。

致謝：本文在試驗過程中得到了海南師范大學生命科學學院陳忠教授的指導和幫助，在此表示感謝！

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The Preliminary Study of Biochemical Fulvic Acidon the Proliferation of Three Types of Tumor Cells in Vitro

Gao Jingang, Chen Mo, He Bin
(Co-constructing Key Labs by Hainan Province and Ministry of Education for Tropical Animal and Plant Ecology,School of Life Sciences, Hainan Normal University, Haikou, 571158)

In this experiment, three kinds of cancer cells, SGC, SPCA and BEL as the object was studied The [3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide]method (MTT)was applied to study on the influence of three kinds of tumor cell proliferation in vitro. Six different concentrations of biochemical fulvic acid were added into the three different cultured tumor cells. The OD values of three different cultured tumor cells were measured, and the concentration of cell inhibition rate of each was calculated. The results showed that the inhibitions of biochemical fulvic acid on three different tumor cells were less than 50% in all concentrations, indicating that they were not sensitive. The proliferation of three different tumor cells did not induce directly inhibited by biochemical fulvic acid. In addition, biochemical fulvic acid could promot growth of the tumor cells to some extent.

biochemical fulvic acid; tumor cell; MTT method, cell proliferation in vitro

TQ314.1，R730.1

A

1671-9212(2014)03-0022-06

2013-11-11

高金崗，男，1957年生，副教授。主要從事細胞生物學和酶組織化學方面的研究。E-mail:gf6363@sina.com。