環(huán)境溫度和鹽度對墨吉明對蝦(Fenneropenaeus merguiensis)胚胎發(fā)育的影響*

楊世平 王成桂 黃海立 陳兆明 孫成波

(廣東海洋大學水產(chǎn)學院 湛江 524088)

生物的早期發(fā)育階段是復雜的生命周期中最為敏感的階段。其中,鹽度和溫度是水生生物自然水體分布范圍的主要決定因子,影響著水生生物的生長與繁殖,尤其是影響水生生物胚胎發(fā)育的最重要的非生物因素。因此,學者們分別研究了鹽度或溫度對方斑東風螺(Babylonia areolata)、尖紫蛤(Soletellina acuta)、長毛明對蝦(Fenneropenaeus penicillatus)等胚胎發(fā)育的影響(施流章,1981;劉建勇等,2005;黃洋等,2011)。不同溫度和鹽度對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)受精卵孵化出膜的時間和受精率有顯著影響,并得出的理想孵化水溫為 28—30°C,鹽度為27.93—33.01(彭昌迪等,2002)。因此,在進行水生生物苗種的大規(guī)模生產(chǎn)時,必須要關(guān)注和了解鹽度和溫度等物理性質(zhì),以及該物種對這些性質(zhì)的要求和適應能力。

墨吉明對蝦(Fenneropenaeus merguiensis)屬于十足目(Decapoda)、枝鰓亞目(Dendrobranchiata)、對蝦科(Penaeidae)、明對蝦屬(Fenneropenaeus),廣泛分布于我國東南沿海,以及亞洲和澳洲的熱帶和亞熱帶海域中。它具有個體大、生長快、肉質(zhì)細嫩、滋味鮮美的特點,我國很早就對其進行了人工養(yǎng)殖。吳琴瑟(1975)就針對墨吉明對蝦的產(chǎn)卵、孵化、胚胎發(fā)育、幼體培育等進行了研究。吳琴瑟等(1985)還研究了墨吉明對蝦育苗期疾病的藥物防治技術(shù)。彭文國等(1996)研究了pH值、鹽度、氨氮濃度變動情況下幼體的耗氧量的變化。近年來,由于凡納濱對蝦進口親蝦的價格節(jié)節(jié)攀升、而養(yǎng)殖成功率卻不斷下降,嚴重影響對蝦養(yǎng)殖效益。廣東省湛江對蝦種苗協(xié)會建議開展墨吉明對蝦的人工繁殖和養(yǎng)殖技術(shù)研究,以期能替代部分凡納濱對蝦的養(yǎng)殖,優(yōu)化我國的對蝦養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)。Hoang等(2002a)研究了墨吉明對蝦在池塘養(yǎng)殖條件生長、性腺成熟和產(chǎn)卵。國外學者還對其性腺催熟、產(chǎn)卵條件、病毒感染、小規(guī)模人工育苗等開展了相關(guān)的研究(Hoanget al,2002b;Naiket al,2002;Wanget al,2002;Zachariaet al,2002,2004b),以期能實現(xiàn)墨吉明對蝦的規(guī)模化養(yǎng)殖。有關(guān)溫度和鹽度對墨吉明對蝦胚胎發(fā)育影響也有報道,但其研究的溫度、鹽度范圍較窄。因此,本文對溫度和鹽度對墨吉明對蝦胚胎發(fā)育的影響進行研究,為開展墨吉明對蝦的人工繁殖、育種等研究提供理論依據(jù),促進其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 親蝦來源與用水

本實驗所用墨吉明對蝦為湛江海區(qū)采捕自然成熟的親蝦,挑選個體大、性腺飽滿的雌蝦。自然海水經(jīng)沉淀、砂濾,強氯精消毒、曝氣后,再用 5×10–6的ETDA二鈉鹽消除重金屬離子。

1.2 胚胎發(fā)育觀察

將親蝦放入 1m3的黑色產(chǎn)卵桶中讓其自然產(chǎn)卵,產(chǎn)卵桶上加蓋黑色塑料膜遮擋光線。每10min觀察桶內(nèi)產(chǎn)卵情況,一旦發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵,立即移走親蝦。在水溫為27.5—27.8°C(自然水溫)、鹽度為28、微沸騰的充氣環(huán)境下進行孵化。從發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵開始,根據(jù)胚胎發(fā)育情況隨時用吸管吸取受精卵或胚胎在顯微鏡下觀察,記錄胚胎不同發(fā)育階段的特征,并對不同發(fā)育階段的胚胎進行拍照,直至幼體出膜。

1.3 溫度對胚胎發(fā)育的影響

取受精卵置于事先準備好的裝有1L干凈海水的2L 塑料桶中,置于 23°C、26°C、29°C、32°C、35°C溫度下孵化。每個溫度設(shè)3個平行組,每組100粒受精卵,鹽度均為 28。為了保證受精卵能懸浮在水中,每個實驗組均進行充氣,充氣量為微沸騰狀態(tài)。分卵的過程在10min內(nèi)完成,以減少受精卵在原有溫度條件下胚胎發(fā)育的影響。觀察統(tǒng)計在不同溫度條件下受精卵的孵化率和幼體出膜時間,為保證各平行組胚胎的充分孵化時間,在觀察到幼體出膜 2h后進行孵化率的統(tǒng)計。溫度實驗控溫裝置采用白色泡沫箱內(nèi)裝淡水水浴的方式進行,高溫組(29°C,32°C,35°C)采用缸內(nèi)電子恒溫器進行加熱,低溫組(23°C,26°C)采用冰袋降溫,所有實驗桶均放置溫度計,以保證控溫的準確性。

1.4 鹽度對胚胎發(fā)育的影響

受精卵在裝有1L干凈海水的2L塑料桶中進行孵化。鹽度實驗組也設(shè) 5個梯度,依次為15、20、25、30、35,溫度為 27.0—27.5°C(小桶內(nèi)的自然水溫)。每個鹽度梯度設(shè)有3個平行組。保證微沸騰的充氣量,分卵的過程在10min內(nèi)完成。觀察統(tǒng)計在不同溫度條件下的孵化率和幼體出膜時間。為保證每個平行組胚胎的充分孵化時間,在觀察到幼體出膜 2h后進行孵化率的統(tǒng)計。高鹽度組(30,35)采用海水精進行調(diào)節(jié),低鹽度組(15,20,25)采用經(jīng)消毒、暴氣處理的自來水進行調(diào)節(jié),鹽度采用手持式折光鹽度計進行測定。

1.5 主要觀測指標及數(shù)據(jù)處理

孵化時間是指從受精卵開始發(fā)育到幼體出膜所經(jīng)歷的時間。孵化率是指受精卵經(jīng)孵化后出膜的幼體總數(shù)與受精卵總數(shù)的比率。最適孵化溫度(鹽度)范圍是指孵化率超過 80%,幼蟲孵化出膜后活力正常的實驗組的溫度(鹽度)范圍。所得數(shù)據(jù)均用平均值±標準差(mean±SD)表示,用Excel 2003和SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行擬合回歸方程和單因素方差分析(ANOVA)和多重比較進行統(tǒng)計分析,并在P＜0.05水平上對結(jié)果進行差異顯著性檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1 墨吉明對蝦的胚胎發(fā)育過程

受精卵 墨吉明對蝦的受精卵,呈橢圓,直徑為280—300μm。在產(chǎn)出10min后,見突起的卵膜,同時見到第1次和第2次成熟分裂時排出的第1極體、第2極體以及多余的精子(圖1a)。

卵裂 受精卵發(fā)生正常的完全均等卵裂。第1、2次卵裂產(chǎn)生的分裂球,可在同一平面觀察到,其均等性特別顯著(圖1b,圖1c)。第3次卵裂后產(chǎn)生8個基本等大的細胞,因其呈現(xiàn)明顯的螺旋卵裂特征,在顯微鏡能同時觀察到6個細胞(圖1d)。在以后的第4、5、6次卵裂分別產(chǎn)生16、32和64細胞,從顯微鏡下可以觀察到的胚胎邊緣的細胞來看,其卵裂球的大小基本一致(圖1e,圖1f,圖1g)。從第1次分裂產(chǎn)生2細胞時起至第6次分裂產(chǎn)生64細胞,平均每次分裂的時間為14.4min。

囊胚期 從第7次卵裂開始,卵裂后細胞形成一個完全封閉的囊胚腔,胚胎進入囊胚期,此期胚胎仍為圓形,在顯微鏡下能觀察胚胎邊緣由細胞分裂產(chǎn)生的分裂球(圖1h)。

原腸期 胚胎的植物極端稍變扁平,其他細胞開始內(nèi)陷,原腸腔逐漸形成。在顯微鏡下不能明顯觀察到胚胎邊緣的分裂球,可明顯觀察到內(nèi)陷處的細胞分裂球(圖1i)。

肢芽期 原腸胚繼續(xù)發(fā)育,4h 33min時,觀察到胚胎兩側(cè)呈現(xiàn)3對肢芽凸起,說明胚胎發(fā)育進入肢芽期。在顯微鏡下觀察不到胚胎細胞的界線。在該期可清楚看到胚胎外包裹的膜(圖1j)。肢芽期發(fā)育時間較長,從不同角度觀察胚胎的形態(tài)差異較大。肢芽期的發(fā)育時間約2h 42min。

圖1 墨吉明對蝦胚胎發(fā)育各期的形態(tài)Fig.1 The morphologies of F.merguiensis embryos in each development stage

膜內(nèi)無節(jié)幼體 7h 15min時,觀察到胚胎的3對附肢末端出現(xiàn)刺狀剛毛,標志著胚胎發(fā)育進入膜內(nèi)無節(jié)幼體期(圖1k)。隨著胚胎的發(fā)育,頭部中央出現(xiàn)了1個棕色眼點(圖1l)。發(fā)育到10h 59min時,觀察膜內(nèi)無節(jié)幼體的附肢能抖動。在11h 50min時,幼體破膜而出。膜內(nèi)幼體發(fā)育時間約4h 35min。

2.2 溫度對墨吉明對蝦胚胎發(fā)育的影響

從表1可以看出,水溫對墨吉明對蝦的幼體出膜時間和孵化率有顯著的影響(P＜0.05)。水溫高于35°C的實驗組,胚胎發(fā)育至囊胚期后陸續(xù)死亡,少數(shù)胚胎發(fā)育到膜內(nèi)無節(jié)幼體期,但不能出膜。水溫在 23—32°C之間胚胎能發(fā)育至膜內(nèi)無節(jié)幼體期,且幼體能順利出膜。水溫為 32°C的實驗組,幼體出膜時間最短555min,孵化率為92.67%±1.53%,幼體活力也正常。水溫為 23°C的實驗組,幼體出膜時間最長(1108.00±49.11)min,比水溫為 32°C的實驗組的幼體出膜時間增加了 553min,且各平行組間幼體出膜時間差較大,達96min,孵化率也僅為65.33%±5.51%。26°C組孵化率最高為 96.67%±1.15%,但 26°C、29°C和 32°C 組孵化率比較接近,各組間差異不顯著(P＞0.05)。從孵化率來看,墨吉明對蝦胚胎發(fā)育在最適溫度范圍為26—32°C。

表1 不同水溫條件下墨吉明對蝦胚胎的發(fā)育情況Tab.1 Embryonic development of F.merguiensis at different temperatures

在23—32°C 的范圍內(nèi),胚胎能正常發(fā)育,幼體出膜時間與水溫之間呈負相關(guān)關(guān)系,孵化水溫(x)與幼體出膜時間(y)存在著多項式函數(shù)y= 4.1111x2–289.13x+ 5590.4(R2= 0.9946)。在最適水溫范圍內(nèi)26—32°C,受精卵的孵化率與水溫之間呈負相關(guān)關(guān)系。在實驗水溫范圍內(nèi),孵化水溫(x)與孵化率(y)也存在著多項式函數(shù)y= –1.9683x2+ 109.67x–1419.8(R2= 0.9188)(圖2)。

圖2 墨吉明對蝦幼體出膜時間、孵化率與水溫的關(guān)系Fig.2 Relationship between temperature and the hatching time,hatching ratio of F.merguiensis

2.3 鹽度對胚胎發(fā)育的影響

從表2可以看出鹽度對墨吉明對蝦的孵化率有顯著的影響(P＜0.05)。鹽度為15的實驗組少數(shù)胚胎發(fā)育到囊胚期死亡,大多數(shù)胚胎發(fā)育至肢芽期后死亡。鹽度在20—35之間胚胎均能發(fā)育至膜內(nèi)無節(jié)幼體期,且幼體能順利出膜。鹽度為20組的胚胎發(fā)育最慢,幼體出膜時間為960min,顯著慢于鹽度為25、30和35的實驗組(P＜0.05),且孵化率也僅為 57.67%±7.09%,顯著低于鹽度為25、30和35的實驗組(P＜0.05)。在鹽度為25、30和35的實驗組,其幼體出膜時間相當,同時觀察到幼體出膜,且孵化率均在90%以上。表明墨吉明對蝦胚胎發(fā)育在最適鹽度范圍為 25—35。統(tǒng)計結(jié)果表明,在鹽度為25、30和35的實驗組的幼體出膜時間和孵化率均無顯著差異(P＞0.05),說明在最適鹽度范圍內(nèi),鹽度對墨吉明對蝦的胚胎發(fā)育沒有顯著的影響。

在鹽度為 20—35的范圍內(nèi),鹽度(x)與幼體出膜時間(y)存在著多項式函數(shù)y= 0.84x2–51.24x+ 1574.6(R2= 0.9333)。在實驗鹽度范圍內(nèi),鹽度(x)與孵化率(y)也存在著多項式函數(shù)y=–0.4438x2+ 26.537x–296.59(R2= 0.9764)(圖3)。

表2 不同鹽度條件下墨吉明對蝦胚胎的發(fā)育情況Tab.2 Embryonic development of F.merguiensis at different salinity

圖3 墨吉明對蝦幼體出膜時間、孵化率與鹽度的關(guān)系Fig.3 Relationship between salinity and the hatching time,hatching ratio of F.merguiensis

3 討論

3.1 溫度對墨吉明對蝦的胚胎發(fā)育

本實驗結(jié)果表明,墨吉明對蝦胚胎發(fā)育最適溫度范圍為 26—32°C。且在 23—32°C 的范圍內(nèi),胚胎能正常發(fā)育,幼體出膜時間與水溫之間呈負相關(guān)關(guān)系。與吳琴瑟(1975)報道結(jié)果相似,該作者認為在適宜的水溫范圍,墨吉明對蝦受精卵的發(fā)育速度隨溫度升高而加速其胚胎發(fā)育適宜水溫為23—32°C。說明水溫對墨吉明對蝦胚胎發(fā)育速度快慢的影響是非常顯著的。在對長毛明對蝦胚胎發(fā)育研究中,也發(fā)現(xiàn)溫度對幼體出膜時間有影響,在一定的水溫范圍內(nèi),溫度越高,發(fā)育越快,出膜時間越短。在鹽度為28.59,水溫為(28±0.5)°C時的孵化時間為13h 20min,而水溫為(24±0.5)°C 的孵化時間為 16h 50min(施流章,1981)。溫度對青蝦(Macrobrachium nipponense)、尖紫蛤、方斑東風螺等的胚胎發(fā)育的影響也呈現(xiàn)相似的規(guī)律(鄒盛希等,2002;劉建勇等,2005;黃洋等,2011)。

從實驗結(jié)果可以看出:溫度既影響墨吉明對蝦胚胎發(fā)育的速度,也影響了受精卵的孵化率。水溫29.0°C時,墨吉明對蝦的幼體出膜時間為641min,與凡納濱對蝦(11.8h)相近(彭昌迪等,2002),它們都具有熱帶型對蝦的共同點。在 26—32°C時,其孵化率均為 90%以上,而在溫度為 23°C時,其孵化率僅為65.33%,說明作為熱帶和亞熱帶品種的墨吉明對蝦期胚胎發(fā)育的溫度要求較高。溫度高可縮短孵化時間,但其孵化率為受到影響,如果進一步提高了溫度,則會引起胚胎畸形,產(chǎn)生敗育(陳昆慈等,2008;黃洋等,2011)。溫度過低時(23°C),墨吉明對蝦的孵化率顯著低于最適溫度內(nèi)各組的孵化率(P＜0.05),說明溫度過低,胚胎發(fā)育會產(chǎn)生滯育。

3.2 鹽度對墨吉明對蝦的胚胎發(fā)育

Roberts(1971)報道,每一個物種都有一個獨特的鹽度范圍適合胚胎發(fā)育和孵化。從實驗結(jié)果來看,鹽度也會影響墨吉明對蝦胚胎發(fā)育的速度和受精卵的孵化率。鹽度為 15時,其胚胎不能正常發(fā)育和孵化。在鹽度為 20時,幼體的出膜時間為 960min,其孵化率也僅為 57.67%,孵化效果明顯差于鹽度為 25、30和35的實驗組。但在鹽度為25、30和35的各實驗組之間,其幼體出膜時間和孵化率均沒有顯著差異(P＞0.05),說明墨吉明對蝦胚胎發(fā)育的鹽度范圍較廣。分布和形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的長毛明對蝦胚胎發(fā)育時,同一溫度條件下,各鹽度組幼體的出膜時間相差不大(施流章,1981)。凡納濱對蝦在鹽度為25.39—33.01范圍內(nèi),最高孵化率為96.4%(鹽度為27.93),但兩端孵化率低于墨吉明對蝦,分別為76.7%和82.4%(彭昌迪等,2002)。說明墨吉明對蝦胚胎發(fā)育的適宜鹽度比凡納濱對蝦寬,孵化率也較高。本實驗的結(jié)果顯示,在鹽度為 25時,孵化率為 96%,是各鹽度組中最高的。而 Zacharia等(2004a)在鹽度為 35,溫度為 33°C和29°C時,取得了墨吉明對蝦較高的孵化率(分別為86.5%和 86.5%)。與本實驗的結(jié)果存在一定的差異,是否與墨吉明對蝦親蝦來源不同有關(guān),還有待進一步研究。水溫和鹽度對墨吉明對蝦胚胎發(fā)育速度快慢的都有顯著的影響,但從水溫和鹽度二者來比較,影響發(fā)育速度快慢的主要因素還是溫度。

致謝在實驗過程中得到馮楚嶂、陳旭東和何炳強同學的幫助,謹致謝忱。

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