菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)Rho型GST和微粒體型GST的序列分析及表達特征研究*

章盈盈 袁澤軼 王 清 李巧梅 吳惠豐 趙建民①

(1.中國科學院煙臺海岸帶研究所 中國科學院海岸帶環境過程與生態修復重點實驗室 煙臺 264003;2.國家海洋信息中心 天津 300171;3.中國科學院大學 北京 100049)

谷胱甘肽 S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)是一類廣泛分布的多功能超家族酶系,主要催化還原型谷胱甘肽(GSH)的巰基與疏水性化合物的親電子基團結合,將其轉化為水溶性代謝產物并排出體外,從而達到解毒目的(Eatonet al,1999)。此外,GST具有過氧化物酶和異構酶活性,可參與氧化應激信號通路的調節,避免 H2O2等引起的細胞死亡(Adleret al,1999;Hayeset al,2005);同時,GST能夠以非催化的形式結合多種內源或外源配體,參與氧化損傷生物大分子的修復及被氧化含巰基蛋白的再生(Sheehanet al,2001;Laborde,2010)。GST 已被發現廣泛分布于動物、植物和微生物在內的所有生物中(Pearson,2005)。根據細胞內定位,GST可分為胞質型(Cytosolic GST)、線粒體型(Mitochondria GST,也稱為Kappa GST)和微粒體型(Microsomal GST)GST三大類。其中,胞質型 GST分布最廣,根據 N-端氨基酸序列、底物特異性等特征,可分成 Alpha、Beta、Rho、Omega等13類;微粒體型GST是一類膜結合蛋白,活化后能夠防止脂質的過氧化作用(Mosialouet al,1993),且多具有過氧化物酶活性(Prabhuet al,2001),現已被歸入參與花生四烯酸與谷胱甘肽代謝(MAPEG)的膜結合蛋白家族(Jakobssonet al,1999;Hayes et al,2005)。

菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)是我國沿海各地廣泛養殖的經濟貝類,其病害問題是制約蛤仔養殖業健康發展的重要瓶頸之一。鰻弧菌(Vibrio anguillarum)作為海洋環境中的常見致病菌之一,已被證明是導致多種雙殼貝類發病及死亡的重要原因。通過探討菲律賓蛤仔抗病功能基因在病原菌感染下的表達規律,有助于深入了解機體的固有免疫防御系統。本研究采用 cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技術,從菲律賓蛤仔中克隆獲得 Rho型 GST(VpGSTR)和微粒體型GST(VpGSTMi)的cDNA全長序列,并運用實時熒光定量PCR方法研究了VpGSTR和VpGSTMi的組織分布及其在鰻弧菌刺激下的時序表達特征,可為進一步探討 GST在菲律賓蛤仔抵御病原侵染中的免疫功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用動物及試劑

實驗用菲律賓蛤仔(殼長 3—4cm)購于煙臺當地水產市場,在過濾海水中暫養10d后開始鰻弧菌侵染實驗;暫養期間,持續曝氣,每天定時投喂扁藻并進行完全換水。

Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,M-MLV反轉錄酶購于美國Promega公司,Taq DNA Polymerase購于美國 Fermentas公司,pMD18-T載體、DNA Marker、SYBR Premix Ex TaqTM均為大連寶生物工程有限公司產品,凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司,其余試劑均購自國藥集團。

1.2 組織取樣及鰻弧菌刺激

實驗用的鰻弧菌購于中國海洋微生物保藏中心,株型為1A07299。將鰻弧菌接種于2216E液體培養基,培養至對數生長期后離心收集菌體;采用滅菌過濾海水重懸菌體,以 107CFU/mL的濃度浸泡刺激菲律賓蛤仔;分別在處理后 6、12、24、48、96h采集血淋巴樣品,低速離心(2000r/min,4°C)收集血淋巴細胞用于總RNA提取,每個時間點采集6個平行樣本。實驗過程中,設置未經任何處理的對照組。

分別采集對照組的肝胰腺、血淋巴細胞、鰓、性腺和肌肉組織,用以測定目的基因的組織表達,每個組織設置6個平行。

1.3 總RNA提取及cDNA合成

總RNA提取使用 Trizol試劑,具體操作參照說明書。cDNA合成按照美國Promega公司的M-MLV反轉錄酶操作說明書進行;以總 RNA為模板,Oligo dT為逆轉錄引物,反應條件如下:70°C 5min,冰上放置 1—2min,42°C 50min,65°C 15min 終止反應,并于4°C結束程序。

1.4 目的基因全長cDNA的擴增

根據實驗室已有的 EST序列,分別設計基因特異 性 引 物 :VpGSTR(F1:5′-TTACCGCTGGATGAA CAAGG-3′,F2:5′-AAGAACGCCAACACTGGATA-3′),VpGSTMi(F3:5′-CGTATTGCCCTTCGTTCTGA-3′,F4:5′-ACATGCCAGCCCTAATCACA-3′)。采用巢氏PCR擴增后,將純化的目的片段連接到pMD-18T載體,轉化至Escherichia coliTop10F′感受態細胞;經藍白斑篩選和菌落PCR鑒定,分別挑取5個陽性克隆送至北京諾賽基因公司進行序列測定。

1.5 生物信息學分析

將獲得的 VpGSTR和 VpGSTMi序列提交Genbank數據庫注冊,并采用 BLAST在線程序進行比對分析。經 CLUSTALⅩ進行多序列比對排列后,用 MEGA4.0構建系統進化樹,計算方法為鄰位相連法(Neighbor-Joining)和自展內部分枝法(Bootstrapping)評定進化樹的可靠性,重復次數為1000。

1.6 VpGSTR和VpGSTMi基因的時空表達

采用ABI7500熒光定量PCR系統,測定目的基因的組織分布及其在鰻弧菌刺激后的時序表達情況。實驗過程中,以菲律賓蛤仔β-actin為內參基因(Actin-RT-F:5′-CTCCCTTGAGA AGAGCTACGA-3′,Actin-RT-R:5′-GATACCAGCAGATTCCATACCC-3′);VpGSTR和 VpGSTMi的基因特異性引物分別為:VpGSTR-F:5′-AAGACGGGGATCTTGTTGTG-3′,VpGSTR-R:5′-TCTCTGTCACGTTCGTTTGC-3′;VpGSTMi-F:5′-ACGTATTGCCCTTCG TTCTG-3′,VpGSTMi-R:5′-AACATGCCAGCCCTAATCAC-3′。熒光定量 PCR參照本實驗室已經優化的擴增體系及反應條件進行(Zhanget al,2012),數據處理采用 2?ΔΔCT法(Livaket al,2001),使用 SPSS軟件進行單因素方差分析(ANOVA),P＜0.05認定為差異顯著。

2 結果

2.1 序列分析

通過序列拼接,分別獲得VpGSTR與VpGSTMi的全長 cDNA序列,GenBank注冊號依次為GQ384394與GQ384399。其中,VpGSTR的開放閱讀框(ORF)包括 705bp(圖1),編碼 234個氨基酸,預測分子量為 27.43kDa,理論等電點為 9.64。經 BLAST比對分析可知,VpGSTR基因編碼的蛋白序列與南極帽貝(Laternula elliptica)GSTR的相似性為64%,而與其它物種的序列相似性較低。SMART軟件分析顯示,VpGSTR為分泌型蛋白,具有典型的谷胱甘肽S-轉移酶 N-末端結構域(G位點,M1—E76)和 C-末端結構域(H位點,T108—R198)。多重比對結果表明,參與谷胱甘肽結合的 N-末端區域較為保守,而與特異性疏水底物結合的C-末端保守性較低(圖2)。

VpGSTMi的ORF包括450bp(圖3),編碼149個氨基酸,預測分子量為 16.74kDa,理論等電點為9.84。BLAST分析發現,VpGSTMi編碼的蛋白序列與太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)及皺紋盤鮑(Haliotis discus discus)的相似性分別是和61%和62%。Pfam在線軟件分析顯示,VpGSTMi具有典型的 MAPEG(Membrane Associated Proteins in Eicosanoid and Glutathione metabolism)膜蛋白結構域(F16—R145)。此外,微粒體型 GST的酶活性位點精氨酸殘基(R114)和酪氨酸殘基(Y121)也高度保守(圖4)。

圖1 VpGSTR全長cDNA序列及推測的氨基酸序列Fig.1 The full-length cDNA of VpGSTR and deduced amino acid sequence

2.2 系統進化分析

系統進化分析結果顯示,胞質型 GST和微粒體型 GST分別聚類(圖5)。本研究獲得的 VpGSTR和VpGSTMi分別歸于Rho型簇和微粒體型簇。VpGSTR首先與菲律賓蛤仔的Rho亞型、南極帽貝(L.elliptica)聚成一簇,這三個物種的 GSTR再與斑馬魚(Danio rerio)、鯉魚(Cyprinus carpio)等魚類的GSTR聚成Rho型GST分支;而VpGSTMi歸屬于MAPEG家族中的GSTMi1,并與GSTMi3、GSTMi2形成微粒體型GST分支。VpGSTMi與長牡蠣(Crassostrea gigas)、皺紋盤鮑(H discus discus)、櫛孔扇貝(Azumapecten farreri)聚成一個分支,表明 VpGSTMi與無脊椎動物的GSTMi親緣關系較近,而與哺乳動物的親緣關系較遠。由上可見,菲律賓蛤仔 Rho型和微粒體型 GST在進化分類中的地位與傳統分類學中的位置相符合。

2.3 VpGSTR和VpGSTMi基因的組織分布

利用實時熒光定量 PCR技術,檢測了 VpGSTR和VpGSTMi基因在菲律賓蛤仔的組織分布特征。結果發現,在肝胰腺、鰓、血淋巴細胞、外套膜和肌肉中均可檢測到VpGSTR和VpGSTMi基因的表達,且均以肝胰腺組織中的表達水平最高。其中,VpGSTR的表達從高到低依次為肝胰腺＞鰓＞血淋巴細胞＞外套膜＞肌肉(圖6a),而VpGSTMi的表達水平則為肝胰腺＞血淋巴細胞＞鰓＞外套膜＞肌肉(圖6b)。

圖2 VpGSTR與其它物種GSTR的多重比對結果Fig.2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of VpGSTR with GSTR from Laternula elliptica (ACM44933),Daniorerio (NP001038525),Cyprinus carpio (ABD67511),Oreochromis aureus (ACT22667)

圖3 VpGSTMi全長cDNA序列及推測的氨基酸序列Fig.3 The full-length cDNA of VpGSTMi and deduced amino acid sequence

圖4 VpGSTMi與其它物種GSTMi的多重比對結果Fig.4 Multiple alignment of deduced amino acid sequence of VpGSTMi with GSTMi from Bubalus bubalis (AEB71425),Xenopus laevis(NP001084720),Homo sapiens (AAP36387),Haliotis discus discus (ABO26660),and Ictalurus furcatus (ADO28130)

圖5 Rho型GST和微粒體型GST的系統進化分析Fig.5 Phylogenetic tree of Rho and microsomal class GST proteins constructed by neighbor-joining method based on the sequences from different animals

2.4 VpGSTR和VpGSTMi在鰻弧菌刺激后的時序表達

采用實時熒光定量 PCR,分析了鰻弧菌刺激后菲律賓蛤仔血淋巴細胞中VpGSTR和VpGSTMi基因的時序表達(圖7)。結果發現,鰻弧菌刺激 6h后,VpGSTR基因表達量較對照組水平無顯著變化;在菌刺激12h和24h后,VpGSTR基因的相對表達量顯著升高(P＜0.05),分別達到對照組的2.5倍和3.5倍;隨著菌刺激時間的延長,VpGSTR基因的表達量逐步回落,在 96h降低到對照組水平。與 VpGSTR類似,VpGSTMi基因的表達量也呈現逐步上升而后又降至對照水平的趨勢;其中,暴露 24h后 VpGSTMi基因的表達量較對照組水平顯著升高(2.7倍,P＜0.05)。

圖6 VpGSTR(a)和VpGSTMi(b)在菲律賓蛤仔中的組織分布特征Fig.6 Tissue distribution of VpGSTR(a)and VpGSTMi(b)determined by qRT-PCR

圖7 菲律賓蛤仔經鰻弧菌刺激后VpGSTR(a)和VpGSTMi(b)基因的時序表達Fig.7 The temporal expression of VpGSTR(a)and VpGSTMi(b)mRNA in the clams post Vibrio anguillarum challenge

3 討論

谷胱甘肽硫轉移酶普遍存在于生物體內,在機體有毒化合物代謝轉化和抗氧化反應等過程中起著重要作用。目前,已在多種海洋動物中先后發現了多種類型的GST的存在(Wanet al,2008;Xuet al,2010;Liet al,2012;Saranyaet al,2012;Umasuthanet al,2012;Zhanget al,2012;Espinozaet al,2013)。本研究克隆獲得了菲律賓蛤仔兩種 GST的 cDNA序列,分別屬于 Rho型和微粒體型家族。序列分析表明,VpGSTR具有典型的谷胱甘肽 S-轉移酶 N-末端結構域(G位點)和C-末端結構域(H位點)。其中,N-末端主要為谷胱甘肽提供結合位點,具有高度保守的色氨酸、絲氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、結氨酸和谷氨酰胺殘基(Parket al,2009);而C-末端為特異性的疏水底物提供結合位點,其氨基酸變異程度較高,利于不同底物的結合(Mannerviket al,1988;Blanchetteet al,2007)。VpGSTMi氨基酸序列存在保守的精氨酸殘基(R114)和酪氨酸殘基(Y121);其中,精氨酸殘基(R114)被認為是MAPEG家族催化功能的作用位點,而酪氨酸殘基(Y121)可能與酶的活性相關。同時,兩個氨基酸殘基位置上的相近,有利于催化形成二級結構(Jakobssonet al,1999;Chenet al,2011)。

由于 GST功能的多樣性,其在不同物種中的組織分布存在較大差異;且多種內源或者外源因素都被證明可介導 GST在組織中表達量的變化。本研究發現,VpGSTR和VpGSTMi廣泛存在于所檢測組織中,并以肝胰腺組織中的表達水平最高。這與已有的研究結果相一致,即GST呈多組織分布,且多數GST在海洋動物的肝胰腺或肝臟組織中呈高表達水平(Kimet al,2009;Parket al,2009;鄒青青等,2010;Chenet al,2011)。肝胰腺被認為是外源毒物和細菌積聚的主要位點,GST作為重要的解毒酶和抗氧化酶,可能參與了病原菌侵染過程中產生的過量活性氧的清除(Pushpamaliet al,2008)。此外,VpGSTMi在血淋巴細胞中也有較高水平的表達,推測其在血細胞介導的免疫防御中發揮了重要作用。類似的現象在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)中也有發現,Delta型GST被認為與血淋巴細胞介導的免疫反應密切相關(Zhaoet al,2010)。

本研究中,通過測定鰻弧菌侵染后血淋巴細胞GST基因表達量的變化,探討了 VpGSTR和VpGSTMi在菲律賓蛤仔免疫防御反應中的作用。結果顯示,鰻弧菌刺激可誘導VpGSTR和VpGSTMi基因的表達,并在刺激后 24h達到基因表達的最高峰,隨后逐漸恢復至初始水平。目前,有關海洋動物受弧菌侵染后 GST基因表達量變化的結果已有報道。例如,馬氏珠母貝(Pinctada martensii)血細胞微粒體型GST和長牡蠣(C.gigas)Sigma型GST在弧菌刺激6h后的表達水平顯著提高(Labreucheet al,2006;Chenet al,2011)。海洋雙殼貝類由于其濾食習性,會從周圍水環境中積累大量的細菌。在應對弧菌等細菌的侵染時,貝類通過改變活性氧(ROS)產生、血細胞吞噬、水解酶活性等來達到免疫目的(Canesiet al,2002)。ROS的增加有利于殺滅入侵細菌,但過量的活性氧對貝類自身也具有毒害作用,因此必須予以清除。抗氧化酶系統對于調節機體內 ROS的水平、維持細胞內穩態、保護機體免受過氧化損傷具有重要作用。研究表明,細菌侵染時伴隨吞噬引起的呼吸暴發產生的ROS、有毒的脂質過氧化代謝產物、有機過氧化物和細菌內毒素等均能使得 GST表達量發生變化(Dubovskiyet al,2008)。因此,在細菌刺激過程中,GST可能協同過氧化氫酶(CAT)、超氧物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、硫氧還蛋白(TRx)等多種酶類參與了活性氧的清除。

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